膈下逐瘀冲剂对沙眼衣原体输卵管炎性不孕小鼠细胞因子影响的研究*

刘 丽 李 杨 李世大



【实验研究】

膈下逐瘀冲剂对沙眼衣原体输卵管炎性不孕小鼠细胞因子影响的研究*

刘 丽1李 杨2李世大3

目的探讨膈下逐瘀冲剂对沙眼衣原体输卵管炎性不孕小鼠细胞因子表达的影响，阐明药物的作用机理和具体疗效。方法选取6～8周雌性C3H/HeN小鼠100只，随机分为空白对照组、模型组、阿奇霉素组、膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组5组，每组20只。采用“沙眼衣原体阴道接种法”复制输卵管炎性不孕模型，接种第8周不同组按组给予药物灌胃15天。处死后免疫组化法检测TNF-a、IL-6、IL-8。结果与空白对照组比较，模型组IL-6、IL-8 及TNF-α阳性表达均升高，差异具有统计学意义(P< 0.05)。与模型组比较，阿奇霉素组和膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-6、IL-8 及TNF-α阳性表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-6、IL-8 及TNF-α阳性表达明显低于阿奇霉素组，具有统计学意义(P<0.05)。结论膈下逐瘀冲剂具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素与膈下逐冲剂合用可以有效治疗沙眼衣原体感染所致输卵管炎。

膈下逐瘀冲剂；输卵管炎性不孕；细胞因子；沙眼衣原体

随着社会的发展，不孕不育症的发病率不断上升，逐渐成为一个世界性难题。据我国性病统计资料显示，由沙眼衣原体(CT)引起的非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、输卵管炎的发病率，在近两年来以23%～75%的速度递增[1]。据美国CDC统计，美国每年有400万生殖道沙眼衣原体感染新发病例[2]。国内外研究均已证实，CT是影响人类生殖健康的重要病原体之一。输卵管炎感染初期多无明显表现，慢性期会有一侧或双侧下腹部隐痛，白带异常等表现，常被人忽视。目前西医主要采用抗生素的治疗，效果尚可，但复发率较高，治疗费用相对较高，且已有不少菌株产生耐药，而中医药的应用占有一定的优势，且发展前景较大。目前寻求一种有效的方法治疗本病是妇科学研究焦点。本病病机多数医家认为与瘀血关系较为密切，《医宗金鉴》云 ：“或因宿血积于胞中， 新血不能成孕……壅塞胞中而不孕。”许润三教授认为输卵管炎积水性不孕形成的主要机制是“血瘀水停，阻于胞脉”[3]。刘丽教授秉承历代医家不孕症治疗理念，结合多年治疗输卵管炎性不孕症经验总结出“活血化瘀、行气止痛”治疗大法，并结合此法对王清任的膈下逐瘀汤加减化裁出我院内制剂“膈下逐瘀冲剂”。本实验致力于探讨其治疗输卵管炎性不孕的作用机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种与试剂沙眼衣原体(由复旦大学附属公共卫生临床中心周晓辉教授馈赠)：保存于本实验室-70℃超低温冰箱。TNF-α、IL-6、IL-8免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 实验动物清洁级6～8周雌性C3H/HeN小鼠，体质量(20±2)g，购买于中山大学动物实验中心，饲养在黑龙江中医药大学妇科实验室清洁动物房，温度18℃～24℃，光暗周期12h。

1.1.3 实验药物膈下逐瘀冲剂由黑龙江中医药大学附属第一医院天江药局提供，药物组成为牡丹皮2 袋，鳖甲1 袋，乌药1 袋，川芎2 袋，香附2 袋，枳壳1 袋，延胡索2 袋，桃仁1 袋，赤芍2 袋，地龙1 袋； 阿奇霉素分散片(哈药集团三精制药诺捷有限责任公司，批准文号：H20057906)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养沙眼衣原体小鼠生物型菌株和McCOy细胞，本实验室保存传代，用RPMI1640生长培养基，蔗糖谷氨基酸钾稀释液(SPG)液中保存。沙眼衣原体小鼠生物型菌株体外培养，制备感染液，用沙眼衣原体小鼠生物型菌株感染McCOy细胞在含有10%胎牛血清的1640培养液中培养，收集单层感染McCOy细胞，超声碎解细胞30s，在4℃下500r /min离心10min，吸取上层液，在4℃下30000r/min，离心45min，取沉淀，用SPG-70℃保存。

1.2.2 膈下逐瘀冲剂、阿奇霉素的制备膈下逐瘀冲剂：由黑龙江中医药大学制剂室提供(产品批号：20100226)每袋6g(相当于生药20g)，日3次口服，根据小鼠与人体表面积转换系数计算(每人每天60 g)，将膈下逐瘀制为：60 g×0.0026=0.156g，0.156g/0.4ml=0.39 g/ml；阿奇霉素片(产品批号：101012)以蒸馏水溶化，调成溶液浓度为6.5g/ml。 每鼠0.4ml/天灌胃。

1.2.3 造模方法雌性C3H/HeN小鼠100只，随机分为空白对照组、模型组、阿奇霉素组、膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组5组，每组20只。除空白对照组外其余4组雌性小鼠先后用1.5%的戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，用0.1%新洁尔灭消毒外阴，再用0.9%的生理盐水清洗；分别用浓度为含106IFU 的感染液50UL，用无菌500UL微量注射器(针头套硅胶硬外麻套管)通过阴道内接种感染。空白对照组用无沙眼衣原体感染的McCOy细胞感染液(SPG)阴道接种，术后禁食不禁水，待小鼠正常排便后常规饲养。

1.2.4 给药方法阴道接种7周后每日上午8 时灌胃1次，每次0.4ml，连续灌胃15天，模型组、空白对照组给同等量的生理盐水灌胃治疗15天。

1.2.5 标本采集方法灌胃15天后，清晨予以禁食、不禁水，采用颈椎脱臼法处死小鼠，开腹找到输卵管，快速剥离性腺旁脂肪、卵巢、子宫，取标本，放入4%多聚甲醛溶液中固定，待用。

1.2.6 指标检测免疫组化法检测TNF-α、IL-6、IL-8蛋白的表达。

1.2.7 免疫组化阳性判断标准采用半定量分析法[4]：判定标准为细胞质中出现棕黄色颗粒，将其染色强度分四级：阴性(-)：细胞无任何着色或出现阳性细胞数比例<5%；弱阳性(+)：细胞轻度着色，呈淡黄色，阳性细胞数占5%～25%；阳性(++)：细胞着色呈深黄色，阳性细胞数占25%～50%；强阳性(+++)：细胞明显着色，呈深棕色，阳性细胞数占>50%。

2 结果

2.1 光镜下输卵管组织病理改变造模后，输卵管组织经HE染色，光镜下可见管壁结构无明显分界，见结缔组织增生，黏膜柱状上皮细胞成矮柱状，顶部纤毛变短，部分脱落，管腔内纤毛排列不整齐，部分管腔堵塞，浆膜层可见淋巴细胞、浆细胞及少量嗜酸性粒细胞等浸润。

2.2 对大鼠输卵管组织IL-6阳性表达的影响与正常组比较，模型组IL-6阳性表达均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，阿奇霉素组和膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-6阳性表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-6阳性表达明显低于阿奇霉素组，具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 对大鼠输卵管组织IL-6阳性表达的影响

2.3 对大鼠输卵管组织IL-8 阳性表达的影响与正常组比较，模型组IL-8阳性表达均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，阿奇霉素组和膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-8阳性表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组IL-8阳性表达明显低于阿奇霉素组，具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 对大鼠输卵管组织IL-8 阳性表达的影响

2.4 对大鼠输卵管组织TNF-α阳性表达的影响与正常组比较，模型组TNF-α阳性表达均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，阿奇霉素组和膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组TNF-α阳性表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；膈下逐瘀冲剂组、膈下+阿奇组TNF-α阳性表达明显低于阿奇霉素组，具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 对大鼠输卵管组织TNF-α阳性表达的影响

3 讨论

输卵管炎性不孕症，检索中医古典著作，未查阅到明确叙述，但根据其少腹部疼痛、痛经、少腹部触及包块等临床特点，可散见于“腹痛”“癥瘕”“痛经”“热入血室”“不孕症”等病证中。在临床治疗输卵管炎性不孕症中运用膈下逐瘀冲剂得到了较好疗效。膈下逐瘀汤为王清任《医林改错》中代表方剂，用于治疗瘀血阻滞膈下证，刘丽教授根据多年治疗输卵管炎性不孕症经验，加减化裁方由川芎、赤芍、牡丹皮、桃仁、香附、延胡索、乌药、枳壳、鳖甲、地龙组成。桃仁活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘。《本草纲目》云：“主瘀血，血闭癥瘕，邪气……”牡丹皮清热凉血、活血散瘀。《滇南本草》：“破血，行(血)，消癥瘕之疾，除血分之热”。赤芍泻肝清热，散瘀活血止痛。《滇南本草》曰：“泻脾火，降气，行血，破瘀，散血块，止腹痛，攻痈疮。”乌药行气止痛，温肾散寒。《本草拾遗》：“主中恶心腹痛……妇人血气，小儿腹中诸虫。”延胡索活血行气止痛。《本草纲目》：“延胡索，能行血中气滞，故专治一身上下诸痛。”川芎活血行气，祛风止痛。《神农本草经》：“主中风入脑头痛，寒痹，筋挛缓急，金疮，妇人血闭无子。”香附疏肝理气，调经止痛。《本草纲目》：“利三焦，解六郁，消饮食积聚，痰饮痞满，胕肿腹胀，脚气，止心腹、肢体、头目、齿耳诸痛……妇人崩漏带下、月经不调，胎前产后百病。”枳壳破气除痞，化痰消积。《日华子》：“破瘕结痃癖，五膈气”。地龙清热、平肝、止喘、通络。《本草纲目》：“性寒而下行，性寒故能解诸热疾”鳖甲滋阴潜阳，软坚散结。用于癥瘕积聚之证。《神农本草经》：“主心腹癥瘕坚积，寒热，去痞息肉，阴蚀，痔，恶肉。”诸药合用共奏活血化瘀，行气止痛之功，又因“气行则血行”故活血药必配以行气药，使瘀滞得除。

细胞因子具有介导和调控免疫、炎症过程的功能，对机体感染、炎症、创伤及免疫应答有调节作用[5]。IL-6、IL-8、TNF-α属于促炎细胞因子。当机体感染CT时刺激单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α、继而活化T细胞，产生TNF-α，TNF-α在正常输卵管和炎性输卵管上皮细胞均有表达，它可诱导机体产生一些有害物质，激活单核细胞，巨噬细胞，TNF-α可诱导机体产生一些有害物质，激活单核细胞，巨噬细胞，诱导IL-6、IL-8合成，促进炎症反应[6]。简言之，三者产生越多，输卵管损伤越重。本实验应用膈下逐瘀冲剂干预沙眼衣原体致输卵管炎性不孕症大鼠，膈下逐瘀冲剂组，阿奇霉素组和阿奇+膈下逐瘀冲剂组均能降低IL-6、IL-8和TNF-α表达，且阿奇+膈下逐瘀冲剂组能明显抑制三者表达。三组结果对比说明膈下逐瘀冲剂具有抗炎作用且抗炎效果优于阿奇霉素，二者合用可使炎性输卵管细胞中IL-6、IL-8和TNF-α表达接近或恢复正常，可能为其治疗输卵管炎性不孕的作用机制，发挥其抗炎作用，从而控制炎症发展。

综上所述，膈下逐瘀冲剂具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素与膈下逐瘀冲剂合用可以有效治疗沙眼衣原体感染所致输卵管炎。

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[4] 刘丽，白椿宇，李世大，等.膈下逐瘀冲剂对输卵管炎性不孕大鼠模型Bcl-2和ICAM-1蛋白表达的影响[J].中医药信息，2015，32(3)：43-45.

[5] 顾立立，李宁.促炎细胞因子对肠上皮细胞紧密连接调控的分子机制[J].肠外与肠内营养,2008，15(2)：114-117.

[6] 陈晓，王凤伟.TLR2和TNF-α与输卵管炎的相关性研究[J].生殖医学杂志，2016，25(1)：56-60.

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.12521504)

1.黑龙江中医药大学附属第一医院妇科二科(哈尔滨 150036)；2.黑龙江中医药大学中医妇科学硕士研究生2014级(黑龙江 150036)；3.黑龙江省中医药科学院男科(黑龙江 150036)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.22.018

1003-8914(2016)-22-3268-03

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2016-08-09)