浓香型721型曲培养周期内风味成分变化的分析研究

吴建峰，孙 莹，季 方，唐群勇，许桂林

（江苏今世缘酒业股份有限公司，江苏涟水223411）

浓香型721型曲培养周期内风味成分变化的分析研究

吴建峰，孙 莹，季 方，唐群勇，许桂林

（江苏今世缘酒业股份有限公司，江苏涟水223411）

大曲是白酒酿造的糖化发酵剂，更是香味物质的前驱体，与原酒的质量和产量密切相关。以顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法跟踪分析浓香型721曲（曲皮和曲心）在培养阶段的风味物质成分的动态变化，包括醇类、酸类、酯类、含氮类、醛酮类、含硫类、呋喃类。样品分析结果表明，多数挥发性风味成分在发酵第1天就会迅速增长，后期经过转化或分解，含量有所下降，20 d后趋于稳定；含氮化合物前期主要是各种氨基酸，2～3 d后吡嗪、吡啶类开始迅速增长，20 d后趋于稳定；种类和含量最高的是酯类化合物，最少的是含硫化合物；大曲发酵前中期可检测风味化合物丰富，曲皮的风味成分种类高于曲心，曲心的风味物质含量总体高于曲皮。

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法； 721型曲； 培养阶段； 风味成分

中国白酒发酵属于典型的自然发酵过程,其特点是在开放的生产环境中,众多不同微生物共同参与发酵，相互作用，最终形成了具有独特风格的产物白酒。“曲乃酒之骨”，大曲既是酿酒原料，又是白酒酿造过程中生物催化剂和微生物的来源之一，对白酒的风格和品质起着至关重要的作用[1-3]。721型大曲是用小麦佐以大麦、豌豆经粉碎，润水后，压制成曲坯，置于曲房中，通过环境自然接种，依据不同的生长状态调节曲房的湿度和温度，微生物菌群经过30 d左右的繁衍交替生长成新曲，随后适当存放则转换为成品曲[4-5]。近年来，多数学者开始关注大曲的风味成分。2007年，范文来等[6]应用GC-MS分析酱香型大曲的风味物质，发现酱香型大曲中含有较多的芳香族化合物和吡嗪类化合物。2011年，张春林课题组采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法分析泸州老窖中高温大曲的挥发性成分，发现曲中含量较高的是醇类、酯类和酮类化合物，另外还含有吡嗪类化合物[7]。2015年，明红梅团队对大曲中挥发性香味物质进行定性和半定量测定，并结合主成分分析法对检测信息进行处理和分析，为进一步量化评价大曲香气及完善大曲质量评价体系提供了参考[8]。

目前已有多篇关于成品曲风味物质成分及其含量的报道，为大曲的合理分级及配备使用提供依据。而关于大曲培养过程的研究较少，本课题组欲采用气相色谱-质谱联用技术跟踪分析721型大曲培养全过程的风味物质成分及其含量变化，结合大曲发酵过程中的微生物群落演替规律和理化指标变化规律初步阐述大曲风味物质产生及影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大曲取样：从曲房不同方位分别取数块曲，取其皮（曲块表面0～2 cm）和心（5～10 cm)分别进行粉碎，混合均匀，堆成圆锥形，分成4等分，留1份作为待测样[9]。取样时间为1 d、3 d、6 d、9 d、13 d、16 d、20 d、25 d和29 d。

耗材及试剂：2-辛醇购自中国物质标准网，正戊烷购自Sigma公司，氯化钠（AR级）购自国药公司。

仪器：美国LECO公司的全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（GC×GC-TOFMS）；数显恒温磁力加热搅拌器购自匡贝实业上海有限公司；超声波清洗器购于上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大曲样品前处理方法

称取5 g绝干曲用50m L水溶解，搅拌10m in，超声波30min（功率70W），然后在-4℃下以4500 r/m in离心10min，得到上层清液，备用。

1.2.2 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法

在15m L顶空瓶中加入5 m L 0.10 g/m L大曲浸提液、2 g NaCl、0.020m L1mg/L 2-辛醇内标溶液，插入50/ 30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，50℃预热平衡7m in，萃取吸附45min，GC解吸5m in(250℃)，用于GC-MS分析。样品通过DB-Wax毛细管柱(30m×0.25mm)进行分离。进样口温度250℃，载气He，流速1.5m L/m in。不分流进样。升温程序：50℃(保持2min)；以6℃/m in升温至240℃(保持10m in)。MS条件：电子电离，采集电压：1500 V，电子能量：70 eV，离子源温度：200℃，质量范围：30～500 u。未知化合物的质谱通过与NIST谱库进行比对，只有当正反匹配对达到800才予以确认。

2 结果与讨论

2.1 大曲风味成分提取与检测方法的选取

经查阅文献，常见的风味成分检测分析的前处理方法主要采取有机溶剂萃取法[10]、液液萃取法[11]、顶空固相微萃取法等[12-14]。有机溶剂萃取法：称取5 g绝干曲用50m L水溶解，搅拌30m in，取上层清液20m L，与20m L乙醚混匀，静置2 h，用吸管吸取5m L上层溶液置于-4℃冰箱里冷冻，待分析。液液萃取法：称取5 g绝干曲用50m L水或12%乙醇水溶液溶解，搅拌30m in，离心，取上层清液置于-4℃冰箱里冷冻，待分析。顶空固相微萃取法：取1 g绝干曲、5m L 0.5 g绝干曲水溶液或5m L 0.1 g/m L曲的浸提液置于顶空玻璃瓶中，于50℃水浴锅中，用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取45m in，随后采用气相色谱-质谱仪分析。实验结果表明：有机溶剂萃取法取得的待分析物质成分单一，峰少，且其峰面积和只有371288，远远不能够说明大曲的风味物质成分；12%乙醇水溶液萃取效果不完全，经过NIST谱库匹对和分析，仅有40种物质；而绝干曲、绝干曲水溶液或绝干曲浸提液的固相微萃取法可以取得200余种分析物，经过NIST谱库匹对，有150余种可知风味物质成分。且绝干曲浸提液的固相微萃取法地相对标准偏差为3.03%，多次能够再现，相对较全面地分析了大曲风味物质成分，故后期本课题组采用绝干曲浸提液的固相微萃取法。

2.2 大曲培养周期内风味成分及其含量的分析研究

大曲从0 d开始入房发酵，第3天倒浆，第5天1层平翻，第8天1层高加2层高，第11天小并房（4层高），第14天翻大火，第19天4层高加5层，第22天5层高加6层高，其得到的成品曲共检测到挥发性风味成分有158种，其中包括醇类19种、酯类15种、醛酮26种、酸类14种、含氮类化合物29种、呋喃类5种，含硫化合物3种及其他40多种，发酵过程的挥发性风味物质含量变化情况分别见图1—图7。

图1 发酵周期内醇类化合物的含量变化

大曲培养周期中生成主要的醇类物质有乙醇、苯甲醇、苯乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、1-辛烯-3-醇等，一般从发酵的第1天开始增加，到发酵的第9天达到最大值，随后含量下降明显，15 d后又再次上升后趋于稳定，尤其是苯乙醇。且醇类物质种类在发酵前中期比较丰富，被微生物利用代谢，后期多数不能够检测。这些物质一般呈现为水果和花香类气味，可能是大曲香味的重要呈香物质。初期入房大曲的温度适宜，微生物尤其是酵母和霉菌开始大量生长繁殖，进行糖代谢、氨基酸代谢，活动丰富，产生大量醇类物质，随后随着曲房温度升高，多数不耐热微生物死亡，且醇类和酸类形成酯，醇类含量大量下降；发酵后期细菌代谢旺盛，代谢产生苯乙醇、苯甲醇等挥发性物质。

图2 发酵周期内酸类化合物的含量变化

大曲发酵培养期中检测到的主要酸类物质有乙酸、2-甲基丙酸、3-甲基丙酸、己酸等，曲皮的酸种类多于曲心，但曲心的酸含量高于曲皮。酸是白酒中的协调成分，具有多种功能，可以使酒体陈酿老熟，增长酒的味感在口腔中持久的程度。酸类物质从发酵的第1天开始增加，到发酵的第5天达到最大值，随后其含量下降明显，15 d后又再次上升后，趋于稳定。培养初始时，微生物代谢产生的醇类被氧化产生酸，且产酸菌代谢活动活跃，乙酸、己酸大量生长，能够明显闻到发酵曲的酸味，尤其是曲心。温度升高，多数产酸菌不耐高温而死亡，且酸和醇形成酯导致酸含量下降。

图3 发酵周期内酯类化合物的含量变化

大曲中检测到的酯类物质主要有乙酯类和己酯类，如乙酸乙酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯等。酯类化合物呈现出花香和水果似香味，能通过醇类和脂肪酸的酯化反应生成，也可以由微生物发酵过程中的乙酰辅酶A途径生成。一般来说大曲中的酯类合成前期可能与乙酰辅酶A途径有关，而后期与酯化反应有关[15]。培养前期，微生物如假丝酵母活动产生酯化酶，促使酸和醇合成酯；培养中期，随着温度的升高，酵母、霉菌死亡，酶活力减弱，酯合成减少；后期温度下降酵母复苏，醇类和酸类化合物增加，合成的酯类化合物增加。

图4 发酵周期内醛酮类化合物的含量变化

醛酮类化合物主要有乙醛、苯乙醛、己醛、苯丙酮、丙酮、2,3-丁二酮等。醛酮类能使酒的香气飘逸，在发酵过程中，原料中的蛋白质和多糖类物质被分解成氨基酸和小分子的还原糖，微生物利用糖和氨基酸代谢产生醛酮等中间体，且氨基酸和还原糖发生美拉德反应产生醛酮类化合物中间体成分[16]，在发酵的第20天就达到最大值，随后趋于稳定。

图5 发酵周期内含硫化合物的含量变化

含硫化合物有甲硫醇、3-甲硫基丙醇、三甲基二硫醚、甲硫基乙酸乙酯、2-氯乙基硫化苯等，具有强烈的放香作用，甲硫醇整个培养周期内都有，其可由细菌或酵母代谢原料中的蛋白质蛋氨酸产生，在第15天左右达到最大，随后趋于稳定，在整个发酵周期内含量相对较低。

图6 发酵周期内含氮化合物的含量变化

含氮化合物前期主要是氨基酸，后期主要是吡嗪类、吡啶类、吡唑类化合物。培养初期，微生物将原料中的蛋白质代谢成各种小分子氨基酸，在细菌的作用下迅速生成吡嗪、吡啶、吡唑等化合物，且培养中微生物如芽孢杆菌代谢一些酶，促进醛酮类和氨基酸物质的美拉德反应，第15天含量达到最大值，随后开始下降，20 d接近一个稳定的水平。

图7 发酵周期内呋喃类化合物的含量变化

呋喃类化合物主要是糠醛、糠醇、糠酮等，多数原料自身就有。培养前期糠醛含量增加，在第15天之后迅速减少。整个培养过程中，呋喃类化合物在第9天和第16天左右有增长点，随后趋于稳定。在发酵过程中有微生物代谢产生糠醛、糠酮，高温进行分解，含量减少。且糠醛可以被微生物利用生成糠醇[17]。

3 结论

应用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱仪跟踪分析了春季721型大曲培养周期内的风味成分的动态变化，包括醇类、酸类、醛酮类、酯类、含氮类、含硫类、呋喃类化合物，其在大曲生成过程中经历了一个先升高后降低的过程。醇类、酸类、醛酮类、酯类从发酵的第1天开始快速生长，20 d后趋于稳定。培养初期生成各种氨基酸，导致含氮类化合物快速增长，随后与还原糖作用生成吡嗪类、吡啶类等物质，丰富了大曲的香味成分。种类和含量最多的是酯类，最少的是含硫类化合物。后期将结合本课题结果与以原料培养的主要微生物的代谢风味成分进行比较，研究大曲中挥发性风味物质变化的内在本质和大曲香味类型的联系。

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Changeof Flavoring Com ponentsof Nongxiang 721Daqu in the Culture Stage

WU Jianfeng,SUN Ying,JIFang,TANG Qunyong and XU Guilin
(Jinshiyuan Distillery Co.Ltd.,Lianshui,Jiangsu 223411,China)

Daqu is the saccharifying&fermenting agent in Baijiu production,and the precursor of flavoring components.It is closely related to the quality and the yield of base liquor.The dynam ic changes in flavoring components of Nongxiang 721 Daqu including alcohols,acids,esters,nitrogen-containing compounds,aldehydesand ketones,sulfur-containing compoundsand furans in the culture stagewere tracked and analyzed by headspace solid-phasem icroextraction-gas chromatography-mass spectrometry.The results showed that,most volatile flavoring compounds increased rapidly in the 1st day of the fermentation,then decreased through transformation or decomposition and became stable after 20 d of the fermentation.Themajority of nitrogen-containing compoundswere all kindsof amino acids atearlier stage.2～3 d later,pyrazines and pyridines began to increase and keptstable after 20 d.Esterswere prom inent in variety and contentand sulfur-containing compoundswere the least compounds.Rich flavoring components could be detected in former fermenting stage,w ith the varieties of flavoring components in the skin of Duqu higher than that in the core of Duqu,and the contentof flavoring components in the core of Duqu higher than that in the skin of Duqu.

headspace solid-phasem icroextraction-gas chromatography-mass spectrometry;721Daqu;culture stage;flavoring components

TS262.3；TS261.1；TS261.7

A

1001-9286（2016）12-0043-04

10.13746/j.njkj.2016068

2016-03-02

吴建峰（1966-），男，江苏南通人，江苏今世缘酒业股份有限公司副总经理，研究员级高级工程师，国家白酒评酒专家，全国五一劳动奖章获得者，发表论文数篇。

许桂林（1988-），女，安徽合肥人，硕士，发表SCI论文数篇，E-mail：youniguilin@sina.com。

优先数字出版时间：2016-11-21；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161121.1648.008.htm l。