钝拟蟹守螺外壳可溶性有机基质的分离与表征

杨 潇，李 娜，郑伶俐，饶日川，薛 燕

(合肥师范学院 化学与化学工程学院,安徽 合肥 230061)



钝拟蟹守螺外壳可溶性有机基质的分离与表征

杨 潇，李 娜，郑伶俐，饶日川，薛 燕

(合肥师范学院 化学与化学工程学院,安徽 合肥 230061)

钝拟蟹守螺的外壳为文石型碳酸钙和有机基质组成的硬组织。有机基质在外壳的形成中有着重要的地位。在本研究中，我们从钝拟蟹守螺外壳中分离、纯化、并部分表征了可溶性有机基质蛋白质(SOM)。SOM主要由蛋白质和多糖组成。凝胶电泳研究发现有四条主要条带分子量大于30kDa。研究发现SOM确实影响了碳酸钙的生物体外结晶。

生物矿化；晶体生长；晶型；有机基质

1 引言

生物矿物质是由无机化合物和生物大分子如蛋白质成分组成的硬组织。在许多有机组织中都存在生物矿物质，它的功能包括机体结构的支撑，保护机体不受外敌的入侵，感知磁力和重力，以及矿物质的储存[1]。此外，生物矿物质形成于受控的条件下，常常有着与其无机条件下形成的同类型矿物质极为不同的性质，如形状、大小、结晶度、同位素和微量元素组成等[2]。在已知的生物矿物质中，含钙矿物占了50%，它们以含钙的碳酸盐、磷酸盐、草酸盐、硫酸盐、和其它矿物质形式存在[3]。因为矿物相的形成需要在由蛋白质和其它大分子组成的复合混合物的存在下才能进行，人们已经进行了一些尝试来纯化和表征活性蛋白质以期了解生物矿化的机理。常见的生物矿物，如牙齿[4]、骨骼[5]和外壳[6-38]，都是化学家和材料科学家非常感兴趣的研究对象。

软体动物分泌形成的外壳是在活性组织外完成自组装过程的一个突出的例子。当软体动物建造自己的外壳时，其外膜钙化的上皮组织排出矿物离子，主要是钙和重碳酸盐。另外，上皮组织分泌出胞外基质，即可溶性有机基质(SOM)，SOM由蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖和多糖组成[39]。这一混合物被释放到外皮层的外部空间，这是由上皮组织、生长中的外壳以及坚韧的角质层所界定的微小体积[40]。在这个过饱和空间里，被释放的大分子与重碳酸盐和钙相互作用生成生物晶粒，这些生物晶粒以一种有序的方式自动聚集。最终产物就是密集组成的有机矿物组件—外壳，其中95%以上的重量是矿物质层[3]。由于外壳蛋白质在生物矿化过程中发挥着控制的作用，它们可以用来合成仿生材料[41-43]。但是，多年来，关于软体动物的外壳蛋白质的原始结构的分辨和识别受到阻碍，这主要是由于其多分散性、多阴离子的性质以及它们经转录后的修饰[40,42]。尽管有着以上困难和阻碍，人们对软体动物的外壳蛋白质的研究在近几年有了重大的进步。目前，科学家已经表征了18种蛋白质，并且，其中的大多数所对应的转录本已被识别。

就目前我们所知，现在还没有对钝拟蟹守螺外壳的研究。本研究拟对存在于钝拟蟹守螺(俗称海锥，英文ObtuseCreeper，学名CerithideaObtusa[44])外壳中的基质蛋白质进行提取、纯化、并部分表征，同时还计划进行生物体外矿化作用的研究。通过本研究，我们希望能够获取钝拟蟹守螺外壳的形态，获取对提取得到的可溶性有机基质(以下简称SOM)的组成的初步了解，同时能够了解SOM在碳酸钙的生物矿化过程中起的作用。

2 材料与方法

外壳材料：从新鲜的软体动物钝拟蟹守螺得到的外壳。

外壳的制备：含有新鲜的软体动物的外壳首先在次氯酸漂白水溶液(5%)中漂白24小时，洗去其中软体活体。之后风干外壳约4小时，再用研钵和杵将其磨成细粉末。

有机基质的提取：在4℃的持续搅拌下，每隔20分钟向40克外壳粉末中加入20ml30%(v/v)的乙酸共14次，使外壳粉末脱钙。得到的浆状物用通用32HettichZentrigugen离心机以4500rpm离心分离30分钟，用以分离上清液(可溶物)和不溶部分。可溶部分用超纯水(Milliporewater)在4℃下透析1天使其完全脱盐。将完全脱盐的溶液冻干，得到SOM用于之后的研究。

SOM中主要基质成分的纯化：将SOM(约20mg)溶于1ml0.1%的三氟乙酸中，并用RP-HPLC进行纯化。用工作站(PerkinElmerPerSeptiveBiosystems)的JupiterC18反相柱(5μg,250×10mm)来对SOM进行分离。色谱柱用0.1%的三氟乙酸平衡，并用乙腈水溶液(80%乙腈)做线性梯度进行洗脱。将之前得到的微型浓缩样品注射入色谱柱中，并以2ml/分钟的速度洗脱。在215nm,254nm,280nm检测到洗脱得到的蛋白质。

根据Laemmli方法[45]在非还原条件下在4-20%的聚丙烯酰胺胶上(Bio-Rad)进行了凝胶电泳实验。蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。

晶体生长实验：将两种实验方法用于晶体生长实验。一种方法是在玻璃盖玻片上培养碳酸钙晶体，将盖玻片置于装有氯化钙溶液的细胞培养皿(Nunc)(4×6)中。具体方法是在电子微量天平(WiggenHauser)上准确称量低压冻干的SOM，将其溶解于10mM氯化钙溶液中最终得到0-1000μgSOM/ml的溶液浓度。将1ml的上述溶液置于装有盖玻片的培养皿的小凹槽中，之后整个装置用铝箔纸盖住，并在其上戳几个小孔。将上述装置放入一个完全密封的干燥器中，在干燥器中放入碳酸铵，碳酸铵的分解释放出气体，并缓慢扩散，使得晶体得以生长。24小时后，将盖玻片从培养皿的结晶凹槽中小心取出，用超纯水(Milliporewater)轻轻洗涤，并在室温下风干，用于后续的分析。

晶体生长还采用了另一种方法。用磨碎的外壳粉末和超纯水(Milliporewater)得到悬浮液(2g/L)，将纯化的二氧化碳通入经搅拌的悬浮液中90分钟，得到过饱和的碳酸氢钙溶液。悬浮液用一次性使用的0.2μm过滤器(Minisart)过滤，然后将二氧化碳通过过滤后的清液30分钟，以确保溶液中的二氧化碳过饱和。将1ml过饱和的碳酸氢钙溶液置于每个22×22mm的盖玻片上，用于生长碳酸钙晶体。将多个盖玻片置于90mm的皮氏培养皿(PetriDish)中。整个装置用铝箔纸盖住，并在其上戳几个小孔。分别在1，2，4，6，14和24小时后将盖玻片从沉降介质中取出，用超纯水轻轻洗涤，并在室温下风干。

形态研究与表征：钝拟蟹守螺的外壳采用电感耦合等离子体发射光谱设备ThermoJarrelAshDuoAxisPlasma进行元素分析。制备样品原液前，用浓硝酸溶解约1mg样品30分钟。稀释钙和镁的原液至标准溶液的要求范围，并将其用于仪器的校准。外壳粉末的X射线衍射实验使用D5005SiemensX射线衍射仪，铜靶辐射在40kV和40mA下进行。将外壳粉末置于塑料载物架上进行衍射实验研究。使用PhilipsXL-30和JEOLJSM6700扫描电镜获取扫描电镜图像。外壳粉末、提取的SOM和生成的晶体使用BioRadFTS165FT-IR分光光度计在4000-400cm-1下进行表征。

3 结果与讨论

钝拟蟹守螺外壳的形态研究和表征：元素分析结果表明外壳的珍珠层和棱柱层中的主要矿物成分都是钙(表1)。与其它外壳相似的是，钝拟蟹守螺的外壳含有镁，镁在外壳的形成中经证实有着重要的作用[46]。与珍珠层相比，整个外壳中矿物质含量较高，说明棱柱层中矿物质含量比珍珠层中矿物质含量要高。这可能是由于，在珍珠层中，软体动物在壳内分泌出较多含量的有机成分，用于帮助外壳晶体的形成生长。棱柱层中较高的矿物质含量在增加外壳硬度上发挥着作用，从而保护软体动物免予暴露于外界环境中。

表1 钝拟蟹守螺外壳的元素组成

为判定钝拟蟹守螺的外壳的晶型，采用红外光谱对外壳粉末进行分析(图1)。

图1 钝拟蟹守螺外壳粉末的红外光谱

858.6cm-1，1504.3cm-1和1440.8cm-1，以及712.4cm-1和 699.6cm-1分别与文石的v2,v3和v4模式相对应。方解石v3模式所对应的1420-1435cm-1区间的典型特征峰并没有在红外光谱中出现。为了对外壳的晶型有更进一步的了解，还进行了X射线的衍射分析(见图2)。图2显示了谱图在2θ-45.96○有清晰的峰，这正是文石晶型的特征峰[51]。而未发现方解石的典型特征峰。因此，得出结论钝拟蟹守螺外壳中的钙是以文石晶型存在的。这与目前研究的大多数软体动物的外壳不同，这些软体动物的外壳中碳酸钙的晶型为方解石[35]。

图2 钝拟蟹守螺外壳粉末的X射线衍射图

SOM的提取和表征：产率由冻干酸性可溶基质的称重获得。酸溶基质的平均产率(两次制备的平均值)是4.37mg/g外壳。

采用红外光谱分析用以研究提取的SOM的化学组成(见图3和图4)。在红外谱图中，3600-3000cm-1的区域内可以观察到蛋白质和多糖所含有的NH和OH的伸缩转动峰。在3000-2815cm-1区间内，没有观察到明显的亚甲基的伸缩转动峰，说明有机基质中不含脂的脂肪族碳氢链。在红外谱图中，发现有蛋白质和多肽的特征峰酰胺I和酰胺II，关于这两个峰在1800-1400cm-1区域的特征值曾有文献进行过详细的研究[47]。酰胺I是蛋白质最强的峰带，并因此被用于与蛋白质的二级结构成分系统关联[48]。在1720-1600cm-1和1580-1500cm-1之间的显著吸收峰分别对应于酰胺I的羰基伸缩振动和蛋白质中酰胺II的NH弯曲振动[48]。曾有研究指出酰胺I的α螺旋结构峰值位置在约1650cm-1。这里酰胺在1610cm-1的吸收峰说明SOM的组成中可能不含有α螺旋构象。在1719和1450cm-1处可以观察到强的羧酸盐吸收峰。可以确定的是只有精氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸和苯基丙氨酸在1800-1400cm-1有着强吸收峰[50]。钝拟蟹守螺的SOM显示出7个高强度的峰带。在1719和1562cm-1的峰一般认为是天冬氨酸,而在1670和1610cm-1的峰对应谷氨酸。而对应于天门冬氨酸的峰(1622和1678cm-1)并未出现在上述谱图中。在1200-880cm-1的范围内，可以观察到多糖组分的多个指纹吸收峰和C-O的弯曲振动峰。因此，谱图显示钝拟蟹守螺的SOM主要由蛋白质和多糖组成。

图3 从钝拟蟹守螺外壳中提取的可溶性有机基质的红外谱图

图4 钝拟蟹守螺外壳中提取的SOM的详细红外谱图((A)显示了酰胺I、酰胺II和含糖区域，(B)显示了酰胺I和II的区域)

酸溶性有机基质(SOM)含有几种不同蛋白质，用SDS-PAGE凝胶电泳法分析，可以观察到4个用考马斯亮蓝深度染色的条带(见图5)。凝胶电泳的第一个部分还有一个约30kD(根据多肽的分子量标准)的条带。出乎意料的是，另外两个主带和一个较弱的条带含有大于30kD的成分，说明SOM含有分子质量很大的组分。

图5 钝拟蟹守螺的SOM的SDS-PAGE凝胶显示出SOM具有较大的分子量

将SOM进一步在JupiterC18柱上用RP-HPLC纯化。图6显示了几个洗脱组分(以a,b,c和d标示)的色谱图，说明了SOM中含有一个主要的蛋白质，几个组分的强度与凝胶电泳中的染色强度一致。

晶体生长的研究：为了解SOM在钝拟蟹守螺外壳钙化中的作用，进行了碳酸钙晶体生长实验。碳酸钙晶体在不同浓度的SOM下进行培养。图7显示了SOM对于碳酸钙体外结晶的影响。在没有SOM存在的空白试验中(图7A)，观察到有菱形的方解石晶体。当提高SOM浓度至50μg/ml，菱形的方解石晶体呈现螺旋位错，即出现在{104}晶面上带有圆形凹陷的“漏斗形”晶体。在这一浓度，菱形的方解石晶体形成，且其形状和大小并未发生明显变化。其凹陷的形成可能是由于蛋白质与生长中的方解石晶体的晶体面相互作用而引起的。另外，可以清晰的看到一个新的球形相，后经辨认是文石。当浓度提高到100μg/ml，更多的球形文石出现，而方解石晶体的形态保持不变。但是，当SOM浓度继续增加至>250μg/ml时，文石相消失，同时方解石晶体开始聚集。这可能是由于SOM的聚集。一旦SOM聚集，它就不能再诱导碳酸钙沉降生成文石。

图6 可溶性外壳蛋白质的RP-HPLC分离(洗脱峰对应含有的不同蛋白质)

图7 碳酸钙的体外结晶：A.没有SOM；B.SOM的浓度为50μg/ml；C.SOM的浓度为100μg/ml；D.SOM的浓度为250μg/ml；E.SOM的浓度为500μg/ml；F.SOM的浓度为1000μg/ml

为了确定球形结构的晶型，采用了红外光谱对于体外生长的晶体进行了分析。图8中显示了碳酸钙晶体的v2和v4的峰图。正如在红外光谱中所看到的，v2的振动峰首先出现在873-875cm-1区间，这与方解石的v2峰带相对应。随着SOM的浓度增加，峰逐渐从874cm-1变成854-857cm-1的小区间，这正是文石的碳酸根变形峰区间。文石的v2峰的强度在SOM浓度达到100μg/ml时达到最大，之后随着SOM的浓度增加逐渐减小。当SOM浓度达到1000μg/ml时，方解石的v2特征峰强度明显增加，而文石的v2特征峰消失。类似的，在SOM浓度为50μg/ml和100μg/ml时，v4峰表明了文石的形成，因为该峰在699.6cm-1处分裂。这与文石v4峰的简并相对应。而这个双峰在SOM浓度继续增加时消失，说明文石在高浓度的SOM下消失。因此，SOM在低浓度下，也许对于晶体生长的晶型控制起到了作用。一旦SOM浓度超过优化点，SOM的浓度增加只会引起晶体数量的增加，而对于碳酸钙晶体的晶型则没有影响。这些红外光谱结果与扫描电镜分析的观察和结论相吻合。

基于以上结果，在此提出晶体生长的机理如下：因为方解石是在自然界中最稳定的晶型，在一般室温环境即一个大气压和合适的温度下，方解石会在没有SOM的条件下生成。当SOM浓度增加时，SOM可能提供了文石的成核中心，同时增强了已经形成的文石的稳定性，从而引起文石数量的增加。但是，当SOM的浓度超过了某一特定值，并且继续增加时，就可能产生蛋白质的聚集，这就抑制了成核中心与碳酸钙之间的交互作用。结果，文石消失，而高浓度的SOM促进了晶体的生长，使得方解石迅速增加。

图8 不同SOM浓度下，碳酸钙晶体体外生长24小时后晶格振动频率范围内的红外光谱：SOM浓度a)0(对照组)；b)50μg/ml；c)100 μg/ml；d)250μg/ml；e)500μg/ml；f)1000μg/ml

根据另一种晶体生长方法，为了了解碳酸钙随时间变化的形成过程，晶体生长实验分别在1小时，2小时，4小时，6小时，14小时和24小时下进行观察。

图9 外壳晶体生长的红外光谱a)1小时； b)2小时；c)4小时；d)6小时；e)14小时；f)24小时

如前所述，已经知道，v2和v4是方解石的振动特征峰。根据外壳晶体在不同时间段下生长的红外光谱(图9)，在正常环境条件下，产生的是方解石而不是文石。这有可能是由于SOM的浓度较低，同时也说明除了SOM，矿化过程还有可能有其它因素，比如pH值，微环境和软体动物本身的存在，对于晶体晶型有着很大的影响。另外，由于特征峰的强度在14小时达到最大值，因此14小时可能是结晶的最佳生长时间。当然，由于研究时间有限，没有对生成晶体的形态进行相关研究。

4 结论

在本研究中，钝拟蟹守螺外壳中的SOM得到了分离、纯化，并使用凝胶电泳，高效液相色谱和红外光谱对其进行了部分表征。同时，还进行了生物矿化实验，并研究分析了在SOM影响下碳酸钙结晶的特点。晶体的性状用扫描电镜，结合红外光谱进行了分析，发现其包含两种碳酸钙晶型，文石和方解石。体外晶体生长研究发现，SOM对于碳酸钙晶体的不同晶型形成具有影响。

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2016-06-15

合肥师范学院校级项目(项目号：2015QN11)

杨潇(1983-)，女，合肥师范学院化学与化学工程学院教师，主要从事化工专业教学工作。

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1674-2273(2016)06-0041-06