以西杂母牛为受体采取胚胎移植技术繁育良种奶牛的应用研究

蔡周山，李建新，李岳灿，许国军，党武吉，梅丽娜

(凉州区畜牧兽医局，甘肃 凉州 733000)



以西杂母牛为受体采取胚胎移植技术繁育良种奶牛的应用研究

蔡周山，李建新，李岳灿，许国军，党武吉，梅丽娜

(凉州区畜牧兽医局，甘肃 凉州 733000)

【目的】为寻求高产奶牛的繁殖模式，促进胚胎移植技术在奶业生产上的应用。【方法】我们在全区27个乡镇，在农户条件下应用性控胚胎以西杂母牛为受体，共移植高产奶牛冷冻胚胎1796头。【结果】妊娠971头，平均妊娠率54.06%，繁活犊牛952头，生母率96.42%。春、秋季的受胎率较高，最高达到55.09%，高于夏季7、8月份最低的52.69%，但差异不显著(\%P>\%0.05)。西杂牛不同黄体级别的A、B级的移植结果A级受胎率为0.558%；B级受胎率为52%。A级黄体与B级移植的受胎率差异不显著(\%P>\%0.05)。【结论】说明采取这一模式进行两种奶牛繁殖是切实可行的，具有推广应用价值。

西杂母牛；胚胎移植；怀期受胎率；体重；初配月龄

凉州区位于河西走廊东端，祁连山北鹿冲积洪积平原，农户素有养殖母牛的习惯，以西门塔尔牛为主的黄牛改良工作在本区已开展了30多年，西杂母牛群体规模已达到14.6万头。目前，凉州区的西杂母牛具有体质结实，体态匀称，耐粗饲，饲养成本低，繁殖性能高、难产率低的优点，以西杂母牛为受体采用胚胎移植技术快速扩繁高产奶牛具有天然优势。为此，我们与美加农生物科技有限公司合作，在全区二十七个乡镇以自然发情的西杂繁殖母牛为受体，利用冷冻高产奶牛性控胚胎开展胚胎移植，旨在通过实践，探讨创新高产奶牛的繁殖模式，促进胚胎移植技术在奶业生产上的产业化应用。

1 移植材料与方法

1.1 移植材料

1.1.1 受体牛选择年龄2～5岁、体重350 kg以上、健康无病、符合受体牛条件的经产西门塔尔杂种母牛。

1.1.2 冷冻性控胚胎由美加农生物科技术有限公司引进提供。选用遗传潜力近10000kg的母牛采集卵子，卵子体外培养成熟，应用性别控制精液，精子获能与卵子体外受精发育而成的7日龄冷冻胚胎。胚胎解冻后复苏率在98%以上，母犊率在96%～98%。

1.1.3 移植材料和器械:2%利多卡因，12%静松灵，孕激素(黄体酮)，高锰酸钾，纯净水，75%酒精棉球，碘酊棉球，5 ml一次性注射器，移植枪，一次性塑料长臂手套，塑料硬外套，近无菌软外套，剪毛刀，卫生纸，保定架。

1.2 移植方法

1.2.1 受体牛的选定 选择的受体牛采取直肠检查的方法复选，对子宫有炎症、形态异常、卵巢囊肿、持久黄体和有流产史的予以淘汰，最后选定移植户和受体牛。对受体牛养殖户进行养殖培训，要求受体牛养殖农户按照《受体牛养殖技术规范》进行饲喂，同时与农户签定胚胎牛移植协议。根据基础母牛各自的不同情况，由分片配种员到农户家中进行防疫、驱虫，饲养指导，农户观察到牛有发情征兆，及时电话通知配种员，配种员通知胚胎供应站。确定发情后第18天进行直肠检查，对不符合移植条件的再次进行淘汰，最后确定使用冷冻胚胎移植的受体牛，并对受体牛进行耳标标记，登记备案。

1.2.2 子宫、卵巢的检查及黄体等级的判定 用直肠检查法依次检查子宫颈、左右两侧子宫角、卵巢的发育情况，对符合条件的受体牛同时要检查卵巢的黄体，根据黄体大小、发育成度、质地软硬、卵巢基础和有无排卵点分为A、B、C三级。A级为正常，卵巢基础好黄体直径在1.5 cm以上，质地软硬适中，触摸感觉如猪肝，与卵巢衔接好，有排卵点；B级为黄体直径在1～1.5 cm之间，质地稍软或稍硬，与卵巢连接痕迹隐性黄体与排卵点不明显，卵巢基础薄弱；C级为黄体过小，与卵巢连接痕迹明显，有小卵泡或卵巢基础过差。C级不能作为黄体移植，视为废弃，A、B级分别进行胚胎移植。

1.2.3 胚胎移植

1.2.3.1 确定移植的准确时间 以发情盛期当天为0 d，第7 d实施胚胎移植，如受体牛出现流血情况，则流血发生的当天为0 d，再加5 d实施移植。移植前先作好受体牛消毒和保定工作，在1～2尾椎间硬膜外注射2%利多卡因5 mL/头和0.4～0.6 mL/头静松灵，使受体母牛尾根麻痹，失去对直肠把握造成的不适反应,以便移植操作。

1.2.3.2 胚胎解冻 解冻过程按照胚胎使用说明书要求在移植点无菌操作室内进行。室内气温恒定26℃进行胚胎解冻。从液氮罐中取出颗粒冻胚后直接投入解冻液，时间在35 s内，然后将胚胎取出放入基础液中3～5 min，再将胚胎取出放入漂洗液3～5 min；最后将胚胎放入移植液，0～2 h内完成装枪移植。

1.2.3.3 胚胎检查 发育正常的胚胎其透明带基本呈圆形，卵裂球均匀而紧凑，无渗出细胞；卵裂球分散或变性后一般不能用于移植。经检查采用A、B级合格胚胎用于移植。

1.2.3.4 移植 移植时用纯净水和0.1%K2MnO4溶液冲洗受体母牛外阴部，再用75%酒精棉消毒外阴部，用卫生纸擦净，双手裂开外阴唇，再将解冻后的胚胎取出擦干，用75%酒精棉擦拭细管，然后轻轻向棉塞段甩几下使冷冻液与保存液混合，剪去细管封口端，装入移植枪(FHK，日本)，外装专用硬外套及无菌软外套，最后将移植枪插入阴道，用非手术法通过直肠把握法将胚胎植入有黄体一侧的子宫角的小弯处(上1/3～1/2处)，在5～8 min内移植完毕。移植时要做到轻、稳、快，防止用力不当损伤子宫造成感染。

1.2.4 妊娠检查及妊娠母牛的饲养管理 认真做好胚胎移植记录，在70天用直检法进行妊检，经直检确诊妊娠的受体母牛，告知养殖户加强饲养管理，供给充足的饲料以保证满足胎儿和母牛的营养需要。防止顶撞、滑到等预防流产，保持舍内和牛体的清洁卫生。

2 移植结果统计

2.1 受胎率

移植时间在2011年3月1日至2012年11月30日参与移植的所有受体牛，之后跟踪测定受胎率(表1)。9个月期间共移植1 796头，妊娠965头，意外流产1头,平均移植受胎率53.72%，产活952头。若按月计，其中受胎率最高时移植数量216头，妊娠数量119头，受胎率为55.09%。最低时移植186头，妊娠数98头，受胎率为52.69%。

表1 胚胎移植受胎率

2.2 生母率

2012年产活犊952头，其中母犊918头，公犊34头，生母率为96.42%。

2.3 移植季节对受胎率的影响

以自然发情的西杂牛为受体移植高产奶牛胚胎，我区主要在每年3～11月进行。 由表1可以看出，4、5、6、9、10月份春秋季的受胎率最高，在54%到56%之间，高于7、8月份，但差异不显著(\%P\%>0.05)这符合我区的气候特点，凉州区夏季7、8月白天气温较高，但温差较大，夜晚相对较凉爽，对牛的繁殖影响不大，由此可以看出，在我区正常条件下春、夏、秋三季均适宜移植。

2.4 黄体不同发育程度对受胎率的影响

采用直肠触摸法判断黄体发育情况，把黄体发育分为3级(即A、B、C三级)，为保证最大限度发挥移植的经济效益，达到B级以上方能输胚。通过配种记录对共同体发育程度对移植受胎率的影响情况进行统计(表2)。移植的1 347头牛中，判断黄体发育程度为A级的812头，占60.3%，移植受胎453头，受胎率为0.558%；B级黄体为535头，移植受胎278头，受胎率为52%。经统计分析表明，A级黄体与B级移植的受胎率差异不显著(\%P\%>0.05)。

表2 黄体不同发育程度对受胎率的影响

3 分析与讨论

3.1 受胎率

从(表1)的移植结果可以看出，移植由美加农有限责任公司提供的美国高产奶牛冷冻胚胎，大面积群体移植的受胎率达到了54.3%，本项目研究的移植技术及在农户中的推广经验值得借鉴和推广。

3.2 营养因素对黄体合格率的影响

对奶牛而言，能量负平衡与产后第一次排卵的时间存在着相关,是否供给全价饲料和单一饲料，对其黄体的形成差异很明显[1];在农户条件下利用西杂母牛做受体牛，其黄体形成的差异则表现不明显。同时在农户条件下很难做到千篇一律饲喂全价饲料，但是做到饲料的多样化，为受体牛养殖户提供切实可行的配方，由于胚胎牛的合同价格均高于本地西杂犊牛的收购平均价，因此胚胎牛繁殖户对受体牛的养殖相对舍得投入，可以按照饲养规程进行饲养。受体牛的膘情可以达到移植需要的要求，黄体合格率较高。

3.3 受体牛黄体等级对胚胎移植受胎率的影响

有人认为黄体体积大一些、质地柔软、有弹性且卵巢表面无滤泡的受胎率高；也有人认为黄体体积大一些、质地硬一些、卵巢表面有滤泡的也可以移植；还有资料报导，以黄牛为受体A、B级黄体受胎率分别为71.7%、63.9%，二者之间差异不显著(\%P\%>0.05)[2]。在大面积开展胚胎移植的实际操作中，受胎率很难达到70%以上。对黄体的判定，我们认为有以下几方面的问题：一是黄体大小相对而言，不同品种、个体之间会有差异，内含、外露的黄体很难掌握其大小;二是黄体大小因个人手感不同有差异，软硬、质地、形状也因人而异，A、B级黄体没有明显的界限;三是技术人员的经验及技术水平、对受体牛卵巢上黄体质量的判定是提高授胎率的主要因素。

3.4 关于受胎率的其他影响因素

除了上述原因，胚胎早期死亡是影响胚胎移植受胎率的一个因素：在胚胎因素中，包括母体遗传因素异常，胚胎自身的生殖激素和识别信号空白的失调，由于亲缘关系受到母体免疫排斥，母体免疫识别失败使异源胚胎死亡[3]。冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响显著;冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著,解冻后A级胚胎存活率、囊胚孵化率显著高于B级胚胎存活率和囊胚孵化率;解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响[4]。另外，母体营养不良和激素失调，尤其是VitA、E的缺乏，医疗上用药不当或过量、移植前后注射疫苗及热应激导致的胚胎营养不足，都是影响胚胎移植受胎率的因素[5]。

4 小结

4.1 在农户条件下，农户为了保证收益，对受体牛的饲养管理水平相对较为精细，多数能按照移植要求饲养殖受体牛，因此在受体牛受胎后，发生意外少，产犊后对犊牛爱护有加，犊牛的成活率高，采用这种方式快速繁育高产奶牛，比在荷斯坦奶牛中选择受体牛具有很大发展优势和潜力。

4.2 通过胚胎移植技术的应用，可以显著提高奶牛纯繁速度，扩大良种奶牛种群，促进奶业发展，同时可以减少种牛引进数量，充分发挥本地西杂母牛繁殖能力，大大降低高产奶牛的繁殖成本，提高西杂母牛的养殖效益。

4.3 2010年我国存栏奶牛1 260万头，奶牛的平均单产只有3 570 kg[6]，无论是数量还是质量方面与世界水平相比均存在较大差距，严重制约着我国奶业的发展。在农户条件下利用西杂母牛，通过奶牛胚胎移植技术的应用，可以大大加快高产奶牛的数量扩张，迅速提高奶牛的产乳量，对于优化农业结构，促进农业增效和农民增收，提高国民身体素质具有十分重要意义。

[1] 马志远,张灵芝.受体牛重复使用对同期发情效果和胚胎移植受胎率的影响[J].黑龙江动物繁殖,2006，14(1)：20-22.

[2] 周顺成，马志远，尹世东.受体牛营养对黄体的影响及黄体等级对冻胚移植受胎率影响的试验研究[J]. 2006，36(4)：5-7.

[3] 佟桂芝，王洪宝，董正德,等.胚胎因素对奶牛体外受精胚胎解冻孵化影响的试验研究[J].中国奶牛，2007，25(6)：25-27.

[4] 明道绪等，生物统计附实验设计[M].北京，中国农业出版社，2002.

[5] 郭志勤，家畜胚胎工程[M].中国科学技术出版社,1998.12.

[6] 《2011年中国奶业统计资料摘要》(内部资料).

Key cwords:Simmental cross bred cow; sex-controlled embryo transplantation; embryo transfer season; progesterone level; gestation rate.

The Application Study of Breeding Excellent Dairy Applying Embryo Transplantation Technology with the Donator of the Simmental Crossbred Cow.

CAI Zhou-shan, LI Jian-xin, LI Yue-can ,XU Guo-jun, DANG Wu-ji，MEI Li-na

(LiangzhouDistrictAnimalHusbandryandVeterinarianBureau,Liangzhou,Gansu, 733000)

【Objective】In order to explore the breeding mode of high yield cows and to promote the industrialization application of the embryo transplantation technology on the milk industry production. 【Method】The experimentation has been implemented in 27 towns of all regions and with Simmental cross bred cow as donator under the conditions of village farmers. There were 1796 frozen embryos of high yield cows were transplanted in total. 【Result】 A total of 971 cows have been pregnancy and the average gestation rate was 54.06% , and produced 952 survival calves with the rate of producing female was 96.42%. The results showed that the gestations with the rate of 55.9% in spring and autumn was higher than summer in July and August, which with the lowest pregnant rate of 52.69%. But the difference was not significant (\%P\%>0.05). The transplantation results of the Simmental cross bred cow with the different progesterone level of A grade and B grade showed that the gestation rate of A grade is 0.558%, the gestation rate of B is 52%. After statistical analysis, the difference of gestation rate of A grade and B grade was not significant (\%P\%>0.05). 【Conclusion】Our study showed that it is feasible and scalable to breed excellent cow by applying this mode

2015-07-20修改日期:2015-07-25

蔡周山(1965-)，男，甘肃省武威市人，大学本科学历，高级畜牧师，从事畜牧兽医技术推广工作。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0010-04