糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶及血浆肿瘤坏死因子-α表达的影响

吕翠岩，张胜容，徐暾海，孙文，赵文景，张竹华，郑桂敏，孟元，王晖，刘铜华

1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100029

糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶及血浆肿瘤坏死因子-α表达的影响

吕翠岩1，2，张胜容1，徐暾海2，孙文2，赵文景1，张竹华1，郑桂敏1，孟元1，王晖1，刘铜华2

1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100029

目的 观察中药复方糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）及血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，探讨其神经保护及镇痛机制。方法 SD雄性大鼠60只，随机选取10只为正常组，其余大鼠采用高脂饲料和小剂量链脲佐菌素诱发2型糖尿病大鼠模型。成模后随机分为模型组、甲钴胺组和糖痹康低、中、高剂量组，每组10只。各给药组给予相应药物干预。16周后取大鼠一侧坐骨神经，放免法检测大鼠血浆TNF-α含量；Western blot检测大鼠坐骨神经p38、p-p38 MAPK蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠坐骨神经p38、p-p38蛋白表达及血浆TNF-α含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血浆TNF-α含量和坐骨神经p-p38蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），各给药组p38蛋白表达降低，但只有糖痹康高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 糖痹康下调大鼠坐骨神经p38、p-p38 MAPK蛋白表达和血浆TNF-α含量，可能是其糖尿病周围神经病变神经保护及镇痛作用靶点之一。

糖痹康；糖尿病周围神经病变；p38丝裂原活化蛋白激酶；肿瘤坏死因子-α；大鼠

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是由糖尿病导致的周围神经系统病变，特点是由于对称的远端周围神经组织退化，导致其感觉的痛苦和缺失。本实验在前期研究基础上，采用高脂饲料和小剂量链脲佐菌素（STZ）诱发2型糖尿病大鼠模型，观察中药复方糖痹康对模型大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）及血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，探讨其神经保护及镇痛机制。

1 实验材料

1.1 动物

6周龄SPF级SD雄性大鼠60只，体质量（160± 10）g。许可证号SCXK（京）2004-0009，北京维通利华动物实验中心。北京中医药大学实验动物中心饲养，温度（23±2）℃，湿度（55±10）％，光照12 h，噪音＜60 dB，自由摄食饮水，分笼喂养。

1.2 药物与饲料

糖痹康由黄芪、女贞子、桂枝、黄芩、黄连等组成，饮片由北京中医药大学中药学院提供；甲钴胺片，卫材（中国）药业有限公司制造，批号111109A。高脂饲料，北京华阜康生物科技有限公司。

1.3 主要试剂与仪器

TNF-α放射免疫试剂盒（北京华力特生物技术研究所），p38、p-p38为兔来源的单克隆抗体（美国CST公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。硝酸纤维素膜（德国Millipore），稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽、半干转电转印仪（美国Bio-Rad），电子天平Sartouris（德国BS224S），紫外分光光度计eppendorf（德国Biophotometer）。

2 实验方法

2.1 造模与分组

大鼠适应性喂养1周，随机选取10只为正常组，普通饲料喂养。其余喂高脂饲料，8周后参考文献[1]造模，予STZ 35 μg/g腹腔内注射。72 h后检测尾尖血血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L为造模成功。成模大鼠随机分为模型组、甲钴胺组和糖痹康低、中、高剂量组，每组10只。

2.2 给药

血糖稳定3 d后开始灌胃给药。糖痹康低、中、高剂量组分别按成人剂量5、10、20倍给药，分别为4.175、8.35、16.7 g原药材/（g·d），均换算成糖痹康为3 mL灌胃；甲钴胺组按成人剂量10倍给药，即1.97 mg/（g·d）, 用蒸馏水配成混悬液3 mL灌胃；空白组和模型组给予等量生理盐水。实验期间大鼠自由饮食饮水，连续16周。

2.3 指标检测

2.3.1 肿瘤坏死因子-α含量检测 给药16周后，大鼠10％水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉采血2 mL，置于预冷的含7.5％ EDTA 30 μL和抑肽酶40 μL无菌采血管中混匀，-4 ℃、3000 r/min离心10 min，分离血浆，放入-80 ℃冰箱备用。采用放免法检测血浆TNF-α含量，按试剂盒说明书操作。

2.3.2 p38丝裂素活化蛋白激酶蛋白表达检测 给药16周后，按350 mg/100 g剂量10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取4 cm左右大鼠坐骨神经置于冻存管，迅速投入液氮中保存。Western-blot检测p38 MAPK蛋白表达。从液氮中取出部分组织研磨，经组织裂解液裂解后上样电泳，初始电压80 V，待溴酚蓝染料前缘进入分离胶上缘后提高电压至100 V，直至溴酚蓝泳出分离胶下缘结束电泳。采用半干电转移仪在PVDF膜上进行蛋白质电转移，恒流30 mA，持续90 min。取出PVDF膜用5％TBST脱脂奶粉封闭，室温振荡60 min。封闭结束后，用TBS-T漂洗液洗10 min×3次，将膜移入杂交袋中，加用漂洗液稀释的抗体（p38、p-p38均为1∶1000），封口，4 ℃孵育过夜；再用TBST漂洗液洗10 min×3次，加漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗（p38、p-p38均为1∶1000），37 ℃振荡60 min。将PVDF膜置ECL显色液中于室温下振荡温育5 min，于暗室中曝光、显影、定影。清水冲洗后，晾干保存，扫描，使用IPP软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 糖痹康对模型大鼠血浆肿瘤坏死因子-α的影响

与正常组比较，模型组大鼠血浆TNF-α含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血浆TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。结果见表1。

4.2 糖痹康对模型大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠坐骨神经p38、p-p38蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组p-p38蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），各给药组p38蛋白表达降低，但只有糖痹康高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2、图1。

表1　各组大鼠血浆TNF-α含量比较（±s，ng/mL）

表1　各组大鼠血浆TNF-α含量比较（±s，ng/mL）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 只数 TNF-α正常组 10 1.24±0.14模型组 10 4.57±1.11**甲钴胺组 10 1.37±0.34##糖痹康低剂量组 10 2.81±0.60##糖痹康中剂量组 10 2.24±0.37##糖痹康高剂量组 10 1.35±0.34##

表2　各组大鼠坐骨神经p38和p-p38 MAPK蛋白表达比较（±s）

表2　各组大鼠坐骨神经p38和p-p38 MAPK蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n p38 p-p38正常组 3 0.34±0.15 0.22±0.80模型组 3 0.86±0.30*0.76±0.13**甲钴胺组 3 0.76±0.31 0.56±0.64#糖痹康低剂量组 3 0.87±0.21 0.57±0.18#糖痹康中剂量组 3 0.60±0.10 0.39±0.05##糖痹康高剂量组 3 0.46±0.10#0.47±0.10##

图1　各组大鼠坐骨神经p38和p-p38 MAPK蛋白免疫印迹图

5 讨论

糖痹康组方源自黄芪桂枝五物汤（《金匮要略•血痹虚劳病脉证并治》）。既往实验研究表明，糖痹康可提高STZ诱导的DPN大鼠周围神经传导速度，改善神经病理，提高坐骨神经Na+-K+-ATP酶活性和cAMP、cGMP含量，且存在剂量依赖关系，对DPN有一定的保护作用；改善STZ诱导的DPN大鼠脂质代谢，升高血清超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶、一氧化氮含量，降低丙二醛含量，减轻氧化应激造成的周围神经损害，具有抗氧化应激作用，显著上调DPN大鼠血浆β-内啡肽的表达，具有神经保护作用及镇痛作用[2-6]。

p38 MAPK是MAPK超家族重要成员之一，与DPN关系最密切的成员，是目前研究最多的氧化应激信号转导通路。激活后的MAPK可停留在胞质中，激活其他蛋白酶，使细胞骨架结合蛋白磷酸化；也可经核转位进入细胞核，磷酸化核转录因子，调控基因表达，促进相关蛋白质的合成和通道改变。DPN患者腓肠神经中p38总体水平升高[7]。糖尿病神经病理痛是DPN患者最常见、严重影响患者生活质量的症状之一，同时其发生的信号转导机制目前尚不清楚。研究表明，p38 MAPK在糖尿病神经病理性疼痛中起关键作用[8]，同时炎性通路的激活是造成DPN的重要途径之一。TNF-α是一种重要的炎症因子，与DPN的发生发展关系密切。越来越多的资料表明，免疫和炎前介质，尤其TNF-α在外周神经病理性疼痛的发生及维持中起着重要作用[9]，其与p38 MAPK之间错综复杂的关系更成为研究的热点之一。实验结果表明，模型组大鼠坐骨神经组织p38、p-p38 MAPK蛋白表达和血浆TNF-α含量较正常组显著升高；糖痹康各剂量组p38、p-p38 MAPK蛋白表达和TNF-α含量较模型组显著降低。由此，我们推测糖痹康可下调糖尿病大鼠坐骨神经p38、p-p38 MAPK蛋白表达和血浆TNF-α含量，可能是其DPN神经保护及镇痛作用靶点之一。

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Effects of Tangbikang on the Expressions of p38 MAPK of Sciatic Nerve and Plasma TNF-α

in Diabetic Rats

LV Cui-yan1,2, ZHANG Sheng-rong1, XU Tun-hai2, SUN Wen2, ZHAO Wen-jing1,

ZHANG Zhu-hua1, ZHENG Gui-min1, MENG Yuan1, WANG Hui1，LIU Tong-hua2(1. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To explore the effects of Chinese herbal compound Tangbikang on the expressions of p38 MAPK of sciatic nerve and plasma TNF-α in diabetic rats. Methods Ten of the sixty male SD rats were selected randomly as normal group, and the rest were fed with high-fat diet and low-dosage STZ was used to induce type Ⅱdiabetic rat models. Model rats were randomly divided into model group, mecobalamine group and Tangbikang low-, medium-, and high-dosage groups, 10 rats in each group. Each medication group was intervened with relevant medicine. Rat unilaterals sciatic nerves were taken after 16 weeks. The content of TNF-α in plasma was determined by radioimmunoassay. Western blot method was used to detect the expressions of p38 and p-p38 MAPK protein of sciatic nerve. Results Compared with normal group, the expressions of p38 and p-p38 protein and content of TNF-α in model group significantly increase (P<0.05, P<0.01). Compared with the model group, the expressions of p-p38 protein and the content of TNF-α significantly decreased after medicine intervention in different doses Tangbikang groups and mecobalamin group (P<0.05, P<0.01). The expression of p38 protein in Tangbikang high-dose group significantly decreased (P<0.05), with statistical significance (P<0.05). Conclusion Tangbikang can reduce the expression of p38 and p-p38 MAPK protein of the rat sciatic nerve, and reduce the content of TNF-α protein in rat plasma, which may be one of the effective targets of neuroprotection and abirritation of diabetic peripheral neuropathy.

Tangbikang; diabetic peripheral neuropathy; p38 MAPK; TNF-α; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.018

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0067-03

国家科技重大专项-重大新药创制（2012ZX09102201-001）；教育部博士点基金立项课题（20110013130001）；北京中医药科技发展资金项目（JJ2015-06）；北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-19）

刘铜华，E-mail：thliu@tom.com

（2015-04-21）

（2015-06-30；编辑：华强）