聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮工艺研究

吴晓芹， 雷绍南， 牛 蓉， 张月珠， 涂秋金， 倪 林， 叶 舟*

(1.福建省顺华信息科技有限公司， 福建 福州 350015；2.福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002)



聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮工艺研究

吴晓芹1,2， 雷绍南2， 牛 蓉2， 张月珠2， 涂秋金2， 倪 林2， 叶 舟2*

(1.福建省顺华信息科技有限公司， 福建 福州 350015；2.福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002)

以总黄酮含量为指标，通过考察静态、动态吸附、洗脱试验,评价聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮的最优工艺，结果表明:最佳工艺参数为上样液黄酮质量浓度2 mg·mL-1，上样量2 BV，加20%乙醇3 BV冲洗杂质，用60%乙醇3 BV洗脱总黄酮,富集后总黄酮纯度提高至39.10%。因此，采用聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮的效果良好，为金丝草黄酮的分离纯化与金丝草总黄酮药理试验奠定基础。

金丝草； 总黄酮； 聚酰胺树脂； 富集

金丝草[Pogonatherumcrinitum(Thunb.)Kunth]，为禾本科金发草属金丝草，多年生草本。中医认为，金丝草有清凉散热，解毒、利尿之功效，全株可入药(罗永亮,2014)。现代药理研究表明金丝草对尿路感染、肾炎、水肿、黄胆型肝炎、感冒高热等有一定疗效。民间常用金丝草煎水当凉茶解暑，对慢性肾功能衰竭有治疗作用；相鲁闽等(2000)将金丝草煎汁用于治疗小儿急性肾小球肾炎，效果极佳；许秀貌(2000)在临床上将金丝草代茶饮用治疗急性肾盂肾炎，也收到很好的效果。金丝草主要成分为黄酮类化合物，且可能为药效成分(陈国伟等，2010；Zhu et al.,2009；刘丽佳，2013)。而金丝草总黄酮纯化工艺仅见林燕如等(2013)采用大孔吸附树脂法进行研究，但总黄酮纯度未得到明确结果。因此，本试验采用聚酰胺树脂吸附法富集金丝草总黄酮，通过单因素试验优选富集工艺参数，这将为后续金丝草总黄酮的药效试验与分离纯化提供依据。

1 仪器与试剂

UVmini-1240紫外分光光度计(日本岛津)；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；分析天平 TP-214(赛多利斯科学仪器有限公司)；30-60目聚酰胺树脂、乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；芦丁对照品(中国药品生物制品鉴定所)；亚硝酸钠(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)，硝酸铝、氢氧化钠(西陇化工股份有限公司)；金丝草(购于福州市西洪路草药店)，经福建农林大学生命科学学院陈伟教授鉴定为Pogonatherumcrinitum(Thunb.)Kunth；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

取金丝草粉末100 g，加60%乙醇2 L，80 ℃加热回流2 h，过滤；滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次滤液得到金丝草提取液，减压回收溶剂至干，备用。

2.2 金丝草提取物总黄酮的测定

2.2.1 标准曲线的绘制 精密称定在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品50.0 mg，置于250 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇定容，精密量取5、7.5、10、12.5、15、17.5 mL，分别置于50 mL的容量瓶中，各加60%的乙醇至17.5 mL，加5% NaNO2溶液0.80 mL，摇匀，放置6 min，加10% Al(NO3)3溶液0.80 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH 10.00 mL，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，于510 nm波长处测定吸光度值。以吸光度A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程：A=12.550C+0.0002(r=1)，线性范围：0.02-0.07 mg·mL-1。

2.2.2 样品测定 精密量取适量待测溶液，按照2.2.1方法，测定各样品溶液A，根据回归方程计算总黄酮含量。金丝草总黄酮生药量含量为32.98 mg·g-1。

2.3 聚酰胺树脂预处理

取30-60目聚酰胺树脂用95%乙醇浸泡过夜，30 ℃烘干，备用。

2.4 上样液制备

取一定量金丝草浸膏，配制成不同金丝草总黄酮质量浓度的上样液。

2.5 聚酰胺树脂富集黄酮工艺摸索

2.5.1 吸附等温曲线 称取0.5 g 预处理好的30-60目聚酰胺树脂，分别加入15个三角瓶中,加入一系列不同黄酮质量浓度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1)的样品水溶液20 mL，置于摇床上振荡24 h，使其充分吸附,过滤,测定滤液中剩余黄酮浓度(平衡浓度)，计算树脂的吸附量。结果见图1，表明当上样液总黄酮质量浓度达到2 mg·mL-1时，上样20 mL基本达到吸附饱和。确定吸附量不再增加的最低初始浓度为聚酰胺树脂柱的上柱浓度，其对应的吸附量则为30-60目聚酰胺树脂的静态饱和吸附量。

图1 上样液质量浓度对金丝草总黄酮吸附量的影响

Figure 1 Effect of sample concentration on adsorption quantity of total flavonoids fromP.crinitum

2.5.2 聚酰胺最佳吸附pH 黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，故pH对其吸附性能具有一定影响。准确称取聚酰胺树脂0.5 g，共5份，各加入黄酮浓度为2 mg·mL-1的上样液20 mL，用盐酸或者氢氧化钠调节溶液pH分别为3、4、5、6、7、8，其他操作如2.5.1。结果表明，金丝草总黄酮吸附量无明显差异，因此不对上样液进行pH调节。

2.5.3 静态吸附动力学曲线 称取聚酰胺树脂0.5 g，加入黄酮浓度为2 mg·mL-1的上样液20 mL，置于恒温摇床上振摇，每隔30 min测一次黄酮浓度，绘制吸附动力曲线。结果见图2，表明聚酰胺树脂吸附金丝草总黄酮速度较快，30 min可基本达到吸附饱和，最后逐渐趋于吸附平衡。

图2 金丝草总黄酮的静态吸附速率曲线

Figure 2 Curve of static adsorption rate of total flavonoids fromP.crinitum

2.5.4 聚酰胺载量曲线 称取干燥聚酰胺树脂3 g，量取总黄酮质量浓度为2 mg·mL-1的上样液，以流速1 mL·min-1连续通过树脂柱(径高比1∶10)，收集流出液，每5 mL收集一份，测定A，计算总黄酮含量，绘制泄漏曲线图。结果见图3，结果显示上样量达到25 mL时，黄酮泄漏率为1.83%，之后随着上样液体积的增大，总黄酮泄漏率逐渐增大，故确定树脂质量∶上样液体积(3∶25)，上样液体积约为2 BV。

2.5.5 最佳洗脱溶剂 称取3 g干燥聚酰胺树脂，取25 mL黄酮浓度为2 mg·mL-1的上样液。聚酰胺树脂柱装好后上样，上样结束后静置30 min。先用3 BV蒸馏水进行洗脱，收集水洗液，同时检测是否有黄酮流出，测定水洗液的干膏量。再依次用体积分数为20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液3 BV进行洗脱，1 BV收集一管，测干膏量与总黄酮浓度。结果测得水洗液干膏量依次为74.7、6.7、3.9 mg，表明用3 BV水洗即可除去大部分杂质。图4 表明20%乙醇洗脱得到的总黄酮量极低，采用40%乙醇洗脱时总黄酮开始大量被洗脱下来，60%乙醇洗脱时又达到一个峰值，故选择20%乙醇3 BV洗去杂质，60%乙醇作为金丝草总黄酮洗脱溶剂。

图3 聚酰胺树脂载量曲线

Figure 3 Curve of adsorption capacity of polyamide resin

图4 不同体积分数乙醇洗脱总黄酮浓度曲线

Figure 4 Curve of different volume fraction ethanol and total flavonoid concentration eluted

2.5.6 洗脱溶剂用量 称取3 g干燥聚酰胺树脂，按照优选的工艺条件进行吸附，加20%乙醇3 BV洗脱除去杂质，加3 BV 60%乙醇洗脱总黄酮，洗脱流速为1 mL·min-1，0.5 BV收集一份洗脱液，测定510 nm处吸光度A，计算洗脱液中总黄酮浓度。结果见图5，60%乙醇3 BV洗脱即可将大部分黄酮洗脱下来，故60%乙醇用量为3 BV。

图5 洗脱溶剂用量洗脱总黄酮浓度曲线

Figure 5 Curve of solvent consumption eluted and total flavonoids concentration eluted

2.5.7 验证试验 分别称取3份干燥聚酰胺3 g，装柱，径高比为1∶10，取总黄酮浓度为2 mg·mL-1的上样液25 mL上样。上样结束后，柱子静置30 min。以1 mL·min-1流速洗脱黄酮，先以3 BV 20%乙醇洗脱杂质，再以3 BV 60%乙醇洗脱黄酮，收集乙醇洗脱液，测定出膏率和总黄酮含量。将洗脱液减压干燥得到20%乙醇洗脱液平均干膏量为89.00 mg，平均总黄酮量为2.50 mg；60%乙醇洗脱液平均干膏量为92.20 mg，平均总黄酮量为36.04 mg；总黄酮纯度提高至39.10%，回收率为72.08%，相对标准偏差(RSD)为0.34%，说明回收率试验的重现性好，该工艺能够较好提高金丝草黄酮纯度。

3 小结与讨论

Wang et al.(2008)发现金丝草甲醇提取液中的黄酮类化合物可以显著抑制经脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7细胞的iNOS表达，进而抑制NO的大量产生，减少NO对细胞的毒害，有利于缓解炎症反应。由于慢性肾功能不全的肾脏对iNOS的降解能力低，不能有效地控制具有细胞毒性的NO不断地产生和释放，从而加重了对肾脏组织的损伤。据临床资料收集分析，金丝草对部分慢性肾衰具有较好的效果。本文对金丝草总黄酮的富集工艺进行探讨，为金丝草黄酮治疗慢性肾衰的药理研究与金丝草黄酮类化合物的进一步分离纯化作前期准备。

林燕如等(2013)研究了大孔树脂分离纯化金丝草总黄酮，但其纯度未得到明确的结果。大孔树脂是物理吸附，且厂家不同，性能有所不同，其分离效果没有聚酰胺好；聚酰胺是氢键吸附，适用于黄酮类成分的分离，具有选择性高、操作简便、吸附与解吸速度快、吸附量大等优点，但聚酰胺由于粒度不均匀，可以通过使用脱脂棉装柱代替有砂芯的柱子或者装柱前过筛解决分离时流速较慢的问题。本文通过静态、动态试验对影响聚酰胺吸附与解吸各种因素的研究，确定了富集金丝草总黄酮的最佳工艺为：上样液总黄酮质量浓度为2 mg·mL-1，上样量为2 BV，以3 BV 20%乙醇溶液冲洗杂质，3 BV 60%乙醇溶液洗脱总黄酮效果最佳。经处理后的金丝草总黄酮纯度提高至39.10%，表明聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮有良好的效果。

陈国伟,李鑫,史志龙,等,2010.金丝草脂溶性化学成分研究[J].承德医学院学报,27(2):216-217.

林燕如,谢琳洁,2013.金丝草总黄酮大孔树脂纯化工艺优化[J].湖北农业科学,52(10):2 393-2 396.

刘丽佳,2013.金丝草的化学成分研究Ⅰ[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,25-33.

罗永亮,2014.金丝草治疗慢性肾衰小鼠活性成分解析方法的初步探索[D].福州:福建农林大学:4-5.

相鲁闽,相鲁建,2000.红背草笔仔草治疗小儿急性肾小球肾炎[J].中国民间疗法,8(12):45.

许秀貌,2000.金丝草代茶饮治疗急性肾盂肾炎[J].中国民间疗法,8(10):42.

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Zhu D,Yang J,Deng X T,et al,2009.A newC-glycosylflavone fromPogonatherumcrinitum[J].Chinese Journal of Natural Medicines,7(3):184-186.

(责任编辑：陈晓雯)

Polyamide resin for purifying technology of total flavonoids fromPogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth

WU Xiao-Qin1,2, LEI Shao-Nan2, NIU Rong2, ZHANG Yue-Zhu2,TU Qiu-Jin2, NI Lin2, YE Zhou2*

(1.FujianShunhuaInfoTechnologyCo.,Ltd,Fuzhou,Fujian350015,China;2.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

The aim of this paper is to optimize purifying technology of total flavonoids from herba,Pogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth by polyamide resin, and the static and dynamic adsorption and desorption behaviors of polyamide resin were evaluated for achieving an optimal purification of total flavonoids. The results showed that optimum purifying technology parameters were as follows: sample concentration of 2 mg·mL-1, sample volume of 2 BV, eluted impurities with 3 BV of 20%ethanol, then eluted with 3 BV of 60% ethanol, and purity of total flavonoids was up to 39.10%. Purification effect of total flavonoids fromP.crinitumby polyamide resin was feasible, and this study could provide experimental basis for the separation, purification and pharmacological experiment ofP.crinitum.

Pogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth; total flavonoids; polyamide resin; purifying technology

2016-05-10; 发表日期： 2016-10-31

福州经济技术开发区科技计划项目合同书(2015MW09)。

吴晓芹(1990-),女,硕士。研究方向：天然产物研究与开发。Email：976376758@qq.com。*叶舟(1957-),男,教授。研究方向：天然产物研究与开发。Email：yezhou1182@126.com。

R284.2

A

1001-4276-(2016)01-0127-05

吴晓芹，雷绍南，牛蓉，等,2016.聚酰胺树脂富集金丝草总黄酮工艺研究[J].武夷科学，32：127-131.