氯胺酮与咪达唑仑对巴马猪脑组织cAMP信号通路的影响

陈 蕊 ， 师铭咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 张 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于东旭 ， 魏成威 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院外科教研室 ， 黑龙江哈尔滨150030)



氯胺酮与咪达唑仑对巴马猪脑组织cAMP信号通路的影响

陈 蕊 ， 师铭咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 张 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于东旭 ， 魏成威 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院外科教研室 ， 黑龙江哈尔滨150030)

为探讨氯胺酮与咪达唑仑对巴马猪中枢神经系统cAMP信号通路的影响及影响情况，研究其中枢作用机制，试验将35头健康巴马猪随机分为对照组、麻醉诱导期、麻醉期和苏醒期四组，在每一期处死取脑组织，用ELISA法分别测定大脑皮质、小脑、丘脑、海马和脑干内cAMP含量。结果：氯胺酮和咪达唑仑分别能够一定程度的降低大脑皮质和小脑中cAMP含量。表明：氯胺酮、咪达唑仑的作用可能通过中枢神经系统cAMP信号通路产生作用，为今后进一步研究提供依据。

氯胺酮 ； 咪达唑仑 ； 巴马猪 ； 脑区 ； cAMP信号通路

AC/cAMP/PKA信号通路是神经系统兴奋过程中的一条重要通路。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是细胞内重要的第二信使，其含量变化受腺苷酸环化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)活力的双重调节[1]，所以cAMP 在AC/cAMP/PKA信号通路中具有重要地位。

氯胺酮、咪达唑仑是动物临床常用麻醉药物，研究其麻醉中枢机制是指导临床用药的关键，但它对中枢cAMP 信号通路的影响目前报道较少，且不同药物对机体cAMP通路影响的报道存在巨大差异，所以，本试验拟研究氯胺酮与咪达唑仑对各脑区cAMP信号通路的影响，探讨其中枢作用机制，为今后该麻醉药的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与方法 盐酸氯胺酮注射液：西安汉丰药业有限责任公司，批号：H20054748；咪达唑仑注射液：宜昌人福药业有限责任公司，批号：H20067040；Tris-Hcl 试剂、蔗糖和乙二胺四乙酸(EDTA)，分析纯，购自上海北诺生物科技有限公司；猪cAMP测定试剂盒：中国卡尔文生物科技有限公司，批号：20120302A。

1.2 试验动物 临床健康的广西巴马小型猪35头，7～8月龄，雌雄兼有，体重32.2±4.3 kg，由东北农业大学外科教研室从三元猪场购入。

1.3 试验动物分组 随机取5头为生理盐水对照组，其余为试验组。生理盐水对照组内肌肉注射生理盐水(10 mL)，试验组分为氯胺酮组和咪达唑仑组，每组15头。分别肌肉注射等体积的生理盐水及氯胺酮(0.07 mL/kg 体重)、咪达唑仑(0.2 mL/kg)。试验动物分别在麻醉诱导期(T1 时期=15 min)、麻醉期(T2时期=45 min)和苏醒期(T3时期=75 min)各时期宰杀5头，采集样本。

时间点选取：对照组和试验组巴马猪的一般临床指标(T、RR和HP)和循环系统指标(DBP、MAP、SpO2、SBP 和ECG)收集和比较，以及对麻醉组中巴马猪麻醉后一系列生物反射活动和巴马猪行为学变化出现的时间进行记录，并结合试验动物麻醉后行为学变化分组标准进行分析，得出小型猪给药后平稳的进入麻醉(T1时期)的时间为23.5±6.5 min，进入深度麻醉(T2时期)的时间为63.3±6.4 min，苏醒期(T3时期)的时间为72.1±4.3 min。所以我们选定T1时期(麻醉诱导期)中的15 min、T2时期(麻醉期)中的45 min和T3时期(苏醒期)中的75 min三个时间点，对氯胺酮和咪达唑仑的中枢作用机制开展研究。

1.4 脑组织样品测定各组巴马猪处死后，用电动石膏锯沿巴马猪额骨中缝，自鼻骨至枕髁之间锯开后，使用拉钩牵拉两侧鼻骨断端，致使颅腔开放，随即取出全部脑组织，用灭菌后的4 ℃生理盐水冲洗脑组织上残留的血迹，并在生理盐水冰板上迅速分离出大脑皮质、小脑、丘脑、海马和脑干后，称重，将预冷的0.32 mol/L的蔗糖缓冲溶液(含0.32 mol/L蔗糖、1 mmol/L Na2HPO4、1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4)按1∶10(W/V)加入到匀浆器中，将组织放入匀浆器中，随后在冰水浴条件下进行充分的研磨。将所得匀浆液移至离心管中，在4 ℃条件下，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定标本中cAMP含量。

2 结果

2.1 氯胺酮对巴马猪不同脑区cAMP含量的影响

如表1所示，在氯胺酮麻醉过程中，小脑中cAMP含量性在麻醉诱导期时较对照组显著降低；在麻醉期，与对照组相比，cAMP含量在大脑皮质、海马和丘脑中均有不同程度的升高，其中丘脑和海马升高显著，脑干和小脑中cAMP含量则呈相反的趋势变化，其中小脑的cAMP含量显著降低；在苏醒期，小脑中的cAMP含量仍较对照组显著降低，而其他各个脑区中cAMP含量均恢复到正常水平。在氯胺酮麻醉过程中，大脑皮质和脑干中cAMP含量未呈明显的变化趋势。

表1 氯胺酮麻醉对巴马猪不同脑区cAMP含量的影响 (U：pmol/mL，n=5)

a**：与对照组比较P<0.01，差异极显著；*：与对照组比较P<0.05，差异显著；b：与麻醉期组比较P<0.05，差异显著，下表同

2.2 咪达唑仑对巴马猪不同脑区cAMP含量的影响 如表2所示，在咪达唑仑麻醉过程中，麻醉诱导期的巴马猪各个脑区中cAMP含量均呈升高趋势，其中海马较对照组升高显著；在深麻醉期中，海马中cAMP含量较对照组仍升高显著；在苏醒期中，与对照组相比大脑皮质和小脑中cAMP含量呈显著降低，而其他各脑区cAMP含量均恢复至正常水平，在咪达唑仑麻醉过程中，脑干中cAMP含量未呈明显的变化趋势。

3 讨论

当触发机体的某些神经细胞后，发生兴奋性，促使神经末梢突触前部释放神经递质，作用于突触后部的受体，通过AC/cAMP/PKA信号通路的一系列信号传递和转导作用，影响神经系统的兴奋性。在AC/cAMP/PKA信号通路中，作为细胞内重要的第二信使的cAMP可介导多种细胞内激素、神经递质及其他信号分子[2]，也可以影响相应蛋白激酶产生系列双向调节作用[3]。cAMP对细胞的调节作用主要是通过激活cAMP依赖性蛋白激酶A(cAMP dependentprotein kinase，PKA)来实现的，cAMP还可以通过PKA磷酸化下游的CREB发挥作用[4]，与此同时，生成的cAMP可被PDE快速水解并生成5、-AMP，致使cAMP失去生理活性[5]。PKA是依赖于cAMP的丝/苏氨酸蛋白激酶，全酶由两个催化亚基C和两个调节亚基R组成。调节亚基上有cAMP结合位点，当两个调节亚基与cAMP结合后，催化亚基呈游离状态而具有活性[6]。

表2 咪达唑仑麻醉对巴马猪不同脑区cAMP含量的影响 (U：pmol/mL，n=5)

氯胺酮(Ketamine)作为一种自1970 年开始在临床上应用的静脉麻醉药，是苯环己哌啶(Phencyclidine，PCP)衍生物，它能选择性地阻断痛觉冲动向丘脑新皮层系统的传导，兴奋脑干及边缘系统，引起意识模糊、短暂性记忆缺失，但意识并未完全消失，常有梦幻、肌张力增加、血压升高等，此状态又称为分离麻醉[7]。咪达唑仑(Midazolam)为水溶性苯二氮卓类药，具有抗焦虑、催眠、抗惊厥、肌肉松弛和顺行性遗忘作用，以及消除半衰期短、起效快、无明显蓄积作用及治疗指数高等特点，是理想的静脉麻醉药[8]。研究表明，多数全麻药能明显改变大脑皮层和小脑等脑区cAMP的含量。张志龙等研究表明，氯胺酮能够明显的增加大鼠不同脑区的cAMP 的含量[9]，丁海雷等研究表明，依托咪酯能够使大鼠各脑区cAMP含量升高[10]，许多静脉麻醉药的作用机制可能涉及cAMP信号通路，其环节可能与GABA及其复合体含量、AC等多方面调节相关。

本试验结果表明，氯胺酮对小脑内cAMP含量有显著抑制作用，而丘脑和海马内cAMP含量呈显著升高的趋势；咪达唑仑可使海马和丘脑内cAMP含量升高。这一结果表明，巴马猪不同脑区的cAMP信号传导系统可能参与了氯胺酮等麻醉药麻醉分子机理的调控。至于氯胺酮使小脑内cAMP含量降低，可能是由于药物剂量不同以及动物种属不同所致，这需作出进一步研究来给予解答。

氯胺酮等麻醉药对巴马猪大脑、海马、丘脑、小脑和脑干内cAMP含量有明显的影响作用，表明cAMP信号传导系统是氯胺酮等麻醉药产生全身麻醉作用的重要机制之一。

[1] 杨国平，王洪军，张锐，等.冷应激对大鼠脑组织cAMP和cGMP水平及AC和PDE生物活力的影响[J].工业卫生与职业病，2009，02：77-80.

[2] 韩羽楠，王振宇.锌与cAMP/PKA-CREB-BDNF信号通路在抑郁症发病机制中的相关性[J].解剖科学进展，2013，02：167-170.

[3] Abe K，Hosoi R，Momosaki S，et al.Increment of in vivo binging of [3H]SCH-23390，a dopamine D1receptor ligand，induced by cyclic AMP-dependent protein kinase in rat brain[J].Brain Res，2002，952(2)：211-217.

[4] Kirschner L S，Yin Z，Jones G N，et al.Mouse models of altered protein kinaseA signaling[J].Endocr Relat Cancer，2009，16(3)：773-93.

[5] 何亚军.氯胺酮对脑电双频指数、环磷酸腺苷及应急指标的影响[D].昆明：昆明医学院博士学位论文，2003．

[6] Pidoux G，Tasken K.Specificity and spatial dynamics of protein kinaseA signaling organized by A-kinase-anchoring proteins[J].J Mol Endocrinol，2010，44(5)：271-84.

[7] 刘伟丽，卞士中，顾振纶，等.氯胺酮成瘾机制的研究进展[J].法医学杂志，2009，03：200-203+207.

[8] 徐波，张兴安.咪达唑仑临床药动学参数的研究[J].中国药房，2009，02：106-108.

[9] 张志龙，曹因明，王钧，等.氯胺酮对大鼠脑内cAMP信使系统的影响[J].中华麻醉学杂志，2001，06：379.

[10] 丁海雷，曾因明，段世明，等.依托咪酯对大鼠皮质、海马cAMP含量的影响[J].徐州医学院学报，2000，01：1-3.

Effects of Ketamine and Midazolam on cAMP signaling pathway in brain tissue in miniature pigs

CHEN Rui ， SHI Ming-xian ， GUO Cen ， CAO Xin-fang ， ZHANG Yu，ZHOU Tong ， LI Xin-ran ， YU Dong-xu ， WEI Cheng-wei ， GAO Li

(Institute of Animal Medicine Surgery Teaching and Research Section，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To explore the effect of ketamine and midazolam on the central nervous system cAMP signaling pathway，35 healthy experimental Bama pigs were randomly divided into four groups：control group，anesthesia inducement period，stage of narcosis and revive period.In each period,the pigs were euthanized for brain samples，cAMP levels in cerebral cortex，cerebellum，thalamus，hippocampus and brainstem were measured by ELISA.Our results showed that ketamine and midazolam were able to reduce cAMP content to a certain level in cerebral cortex and cerebellum independently.Our data indicate that ketamine and midazolam might act on central nervous system cAMP signaling pathway.

Ketamine ； Midazolam ； Bama pigs ； Brain regions ； cAMP signaling pathways

GAO Li

2015-11-12

国家自然科学基金(31372491，31572580)

陈蕊(1990-)，女，硕士，从事临床兽医工作，E-mail：563928610@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.7

A

0529-6005(2016)10-0093-03