快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析方法的建立

王 旗 ， 管 笛 ， 武会娟 ， 裴星瑶 ， 彭 涛 ， 江海洋

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市理化分析测试中心 ， 北京海淀100089 ；3.北京市基因测序与功能分析工程技术研究中心 ， 北京海淀100094)



快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析方法的建立

王 旗1，2，3， 管 笛2，3， 武会娟2，3， 裴星瑶1， 彭 涛1， 江海洋1

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市理化分析测试中心 ， 北京海淀100089 ；3.北京市基因测序与功能分析工程技术研究中心 ， 北京海淀100094)

本研究旨在研制一种快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析试纸条。将包被抗原(0.80 mg/mL)和羊抗鼠IgG(1.01 mg/mL)喷涂在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质检线。对制备荧光微球抗体免疫复合物(免疫探针)的工艺参数做了一系列的优化，同时比较了不同标记方法对标记效率及稳定性的影响。结果表明，在pH值为6.0的最佳缓冲体系条件下，催化剂碳化二亚胺(EDC)用量为5 μg，抗体100倍稀释添加20 μL，检测时间低于25 min，检测限为25 μg/L。本试验研制的荧光微球免疫层析试纸条具有简便快速、特异性良好、样本无需前处理等特点，可用于基层奶站和现场快速筛选。

荧光微球 ； 泰乐菌素 ； 免疫层析方法 ； 试纸条

目前牛奶中泰乐菌素(tylosin，TYL)残留的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[1]、高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)[2]和酶联免疫吸附法(ELISA)[3]。这些方法虽然准确可靠，但是前处理复杂且费用昂贵，而免疫层析方法因简便快速、成本低廉得到广泛应用。胶体金作为主要标记物，具有对标记条件要求苛刻且抗体用量多的劣势，而荧光微球具有形态稳定、单分散性良好、发光效率高等特点，所以本试验通过优化抗体用量、EDC用量、缓冲体系pH值和标记方法等工艺参数，首次成功建立了检测牛奶中TYL的荧光微球免疫层析方法。该方法灵敏度高，特异性好，简便快速，可用于现场快速检测牛奶中TYL残留，为我国奶制品安全保驾护航。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光微球(0.2 μm，红色，580/605)泰乐菌素标准品，购自美国Sigma-Aldrich Co.Ltd；包被抗原(TYL-BSA)、抗TYL单克隆抗体、羊抗鼠IgG(GXM)，购自北京市维德维康生物技术有限公司；PVC塑料胶板、滤血膜、吸水纸，购自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)，购自美国Millipore公司；ZX1000喷膜平台，购自美国BioDot公司；截条机，购自上海杰一生物有限公司；三用紫外分析仪WFH-203，购自上海驰唐实业有限公司。

1.2 免疫探针的制备 标记方法1[4]：在1.5 mL离心管中依次加入1 mL MES缓冲液(pH值6.0)，15 μL荧光微球，20 μL 100倍稀释的抗TYL单克隆抗体，10 μL 0.3 mg/mL的EDC和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，转速为30 r/min的条件下反应2 h。加入20 μL 20%BSA封闭荧光微球表面未反应的活化位点。15 min后，以8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀用1 mL复溶液重悬，放在4 ℃备用。1.3 荧光微球试纸条的制备 将TYL-BSA(0.80 mg/mL)和GXM(1.01 mg/mL)按照0.8 μL/cm喷涂在NC膜上，分别作为检测线(T线)和质检线(C线)，37 ℃干燥2 h。将NC膜、吸水纸和滤血膜依次粘贴在PVC塑料胶板，重叠部分为2 mm，用裁条机切成宽度为4 mm的试纸条，放在装有干燥剂的自封袋中备用。

1.4 检测程序和结果判定 在微孔中加入5 μL免疫探针和150 μL样本溶液，室温孵育3 min。插入试纸条后层析20 min，在紫外线下观察结果。若T线和C线均呈现红色荧光条带，则样本判为阴性；若T线消失，C线呈现红色荧光条带，则样本判为阳性；若C线消失，则无效(见中插彩版图1)。1.5 标记方法的比较 按照标记方法2(先加入荧光微球，EDC和NHS，后加入抗体)[5]和标记方法 3(先加入抗体和荧光微球，后加入 EDC 和NHS)[6]制备免疫探针，比较偶联效率及稳定性。

1.6 荧光微球试纸条性能评价 检测限：在脱脂牛奶中添加TYL标准品：0、5、10、15、20、25 μg/L，以T线荧光强度消失的最低标准品添加浓度作为检测限。特异性：在PBST缓冲液中分别添加终浓度为200 μg/L的其他大环内酯类抗生素，在紫外线下观察试验结果。准确性：取经仪器方法验证无TYL残留的20份牛奶样本，分别添加TYL标准品为10 μg/L和 25 μg/L，计算假阴性率和假阳性率。每个浓度重复5次。

2 结果与分析

2.1 抗体用量的选择 在一定范围内，随抗体用量增加，T线荧光强度逐渐增强。抗体用量超过20 μL时，T线荧光强度基本不再改变。这表明荧光微球所能偶联的抗体用量已处于饱和状态。继续增加抗体用量，不仅提高成本，而且可能会因自体偶联影响标记效率或因非特异性吸附而出现假阴性结果，所以抗体最佳用量为20 μL。

2.2 催化剂用量的选择 EDC作为一种羧基催化剂，会影响荧光微球表面羧基的活化程度，所以本试验优化了EDC用量。如中插彩版图2(A)所示，EDC用量在0～125 μg范围内，随EDC用量的增加，T线荧光强度先增强后减弱。此外，将免疫探针在4 ℃放置24 h，观察其稳定性。如中插彩版图2(B)表明，当EDC用量小于5 μg时，免疫探针都较稳定，而用量为25 μg和125 μg时，免疫探针均发生不同程度的聚集，且用量越大，聚集越明显。可能过多EDC会导致荧光微球表面的羧基过度活化，增加了自体偶联的几率，降低了标记效率和复合物的稳定性。此外在1～5 μg范围内细微调试EDC用量时，结果并无显著差异，所以EDC最佳用量为5 μg。

2.3 缓冲液pH值的选择 调节标记体系的酸碱度，评价pH值对荧光微球标记效率的影响。在不同pH值缓冲体系条件下标记的免疫探针离心后效果如中插彩版图3(A)所示，当pH值大于6.0时，标记效率低且上清液混浊。沉淀复溶后，试纸条检测结果如中插彩版图3(B)所示，pH值为6.0时，T线荧光强度最强。这可能是此时抗体活性最强，易与荧光微球表面活化的羧基发生活泼酯反应，所以缓冲液的最佳pH值为6.0。

2.4 不同标记方法的比较 本研究比较了3种荧光微球标记抗体的方法，结果如表1所示，3种方法透膜时间和层析效果没有显著差异。方法3上清液抗体含量最低且荧光强度最强，但方法1稳定性最好。本试验在较高标记效率的前提下，本试验为保证免疫探针的稳定性最终采用方法1。但是不同抗体和荧光微球标记时，反应物的加入顺序也不尽相同，其反应机理还需在后续工作深入探讨，但目的都是为了获得标记效率更高更稳定的免疫探针。2.5 检测限、特异性和准确性 如中插彩版图4(A)所示，随TYL标准品浓度增加，C线始终呈现红色荧光条带。TYL浓度为25 μg/L时T线荧光强度消失，即检测限为25 μg/L。如图4(B)所示，2-8号试纸条T线荧光强度和1号相近，表明该试纸条和其他药物无交叉，特异性良好。在20份牛奶样本检测中，无假阴性和假阳性结果，表明该方法准确可靠。

表1 不同标记方法的参数比较

a+：荧光强度；t：样本从滤血膜底端刚刚层析到达吸水纸的时间；b+：滤血膜上探针的残留情况；c+：NC膜上的非特异性吸附情况；d+：沉淀物

3 讨论

本试验主要探讨了制备免疫探针的工艺参数，首次建立了牛奶中TYL残留的荧光微球免疫层析方法。和相关文献[5]对比，本试验中EDC用量明显降低，但仍能保证良好的标记效果，可能是化学试剂对抗体活性有一定的影响，同时也证明了催化剂低量高效的特点。其次文献[5]中报道缓冲液pH值在5.0～7.0范围内，pH值为6.0时荧光强度几乎最弱，与本试验中结果截然相反，侧面说明了不同抗体标记时所需要的环境不同，在实际标记中不可照搬文献。

目前胶体金因简便快速、成本低廉、结果直观等优势得到广泛应用[7]，如快速检测A型流感[8]，但胶体金试纸条灵敏度低且对标记环境要求苛刻。而荧光微球作为一种新型标记物，标记时采用共价结合代替静电吸附[9]，提高了免疫探针稳定性和样本耐受性，减少了假阴性率，此外克服了胶体金标记物需大量聚集而显色的劣势，其发光强度可以随激发光的增强而增强，所以有望提高免疫检测技术的灵敏度[10]。然而目前应用于食品安全检测的荧光微球标记产品在市场上很少见，限制因素主要为荧光微球本身易淬灭，标记技术中抗体的活性及结合物的稳定性难以维持[10]。但随科学技术的进步，这些难题必然得到解决并转化为商品化检测产品，为保障食品安全做出贡献。

4 结论

本试验成功研制了牛奶中TYL残留的荧光微球试纸条，快速灵敏，特异性良好，稳定可靠，牛奶样本无需稀释，检测限完全满足国家最高残留限量的要求，尤其适用于基层奶站和现场快速检测，对保障我国奶制品安全具有重要意义。此外，对比了三种标记方法，结果表明，将抗体、荧光微球、EDC和NHS同时加入缓冲液的标记方法，标记效率高且稳定性最好，为推广荧光微球标记产品在实际中的应用提供了较高的参考价值。

[1] 王海涛，张睿，段宏安，等.高效液相色谱法同步检测牛奶中替米考星、泰乐菌素和螺旋霉素残留量[J].分析试验室，2008，27(7)：98-101.

[2] 谢丽琪，岳振峰，唐少冰，等.高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留量的研究[J].分析试验室，2008，27(3)：5-8.

[3] Peng D，Wang S，Chen Y，etal.Development and validation of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbentassay for the screening of tylosin and tilmicosin in muscle，liver，milk，honey and eggs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60(1)：44-51.

[4] 李怀明，赖卫华，徐恒毅，等.基于荧光硅球的克伦特罗快速定量免疫层析试纸条的研制[J].分析化学，2011，39(11)：1647-1652.

[5] Chen R，Li H，Zhang H，etal.Development of a lateral flow fluorescent microsphere immunoassay for the determination of sulfamethazine in milk[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405(21)：6783-6789.

[6] 徐飞.氨基糖苷类药物残留检测筛选和确证方法的研究[D].北京：中国农业大学，2014.

[7] 陆必科.胶体金免疫层析技术在兽药残留检测中的应用及发展前景[J].饲料博览，2014(7)：46-50.

[8] 高海岗，王子平，任晓晔，等.A型流感金标快速检测试纸条的研制及初步应用[J].中国畜牧兽医，2015，31(3)：43-44.[9] 郭诗静，唐海波，齐维.免疫荧光层析法快速检测猪尿中克伦特罗含量[J].现代食品科技，2013，29(5)：1154-1156.

[10] 吴刚，姜瞻梅，霍贵成，等.胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用[J].食品工业科技，2007，28(12)：216-218.

Fluorescent Microsphere Based Immunochromatographic Assay forRapid Detection of Tylosin Residues in Milk

WANG Qi1，2，3， GUAN Di2，3， WU Hui-juan2，3， PEI Xing-yao1， PENG Tao1， JING Hai-yang1

(1.College of Veterinary Medicine,China Agriculture University，Beijing 100193,China;2.Beijing Center for Physical &Chemical analysis，Beijing 100089,China；3.Beijing Engineering Technology Research Centre of Gene Sequencing and Gene Function Analysis，Beijing 100094,China)

The fluorescent microsphere test strip was developed for rapid detection of tylosin(TYL)residues in milk in this paper.TYL-BSA antigen(0.80 mg/mL)and goat anti-mouse IgG(1.01 mg/mL)were sprayed on the nitrocellulose membrane as the detection line and the control line respectively.The parameters in the construction of fluorescent microsphere-antibody complexes as the immune probes were optimized，so did the effect of different labeling methods on labeling efficiency and stability.The results showed that the optimal pH of buffer system was 6.0，and the amount of EDC and antibody(100-fold dilution)were 5 μg and 20 μL.The test was finished in 25 min，and the limit of detection was 25 μg/L in milk sample without pretreatment.In conclusion，the developed assay was simple，rapid，specific，and suitable for rapid screening of milk stations and sites.

fluorescent microspheres ； tylosin ； immunochromatographic assay ； strips

JIANG Hai-yang

2015-09-18

北京市优秀人才青年骨干个人项目(2014400685-627G27);北京市科学技术研究院青年骨干计划(201415)

王旗(1991-)，女，硕士，研究方向为兽医药理学与毒理学，E-mail：wangqisuzimo@163.com

江海洋，E-mail：haiyang@cau.edu.cn

TS252.7

A

0529-6005(2016)10-0071-03