淫羊藿多糖对醋酸铅致生精障碍小鼠的治疗作用

赵东海 ， 黄建玉 ， 唐际兰 ， 何金林 ， 毕莲茹

(1.吉林医药学院基础医学院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林医药学院临床医学院 ， 吉林吉林132013)



淫羊藿多糖对醋酸铅致生精障碍小鼠的治疗作用

赵东海1， 黄建玉2， 唐际兰2， 何金林2， 毕莲茹2

(1.吉林医药学院基础医学院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林医药学院临床医学院 ， 吉林吉林132013)

为观察淫羊藿多糖对生精障碍BALB/c小鼠的治疗作用，将60只BALB/c雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组、淫羊藿多糖高、中、低剂量组，每组10只；除空白组外，其余各组小鼠腹腔注射醋酸铅制备小鼠生精障碍模型。通过灌胃不同浓度淫羊藿多糖及阳性药物维生素E，研究了淫羊藿多糖对生精障碍小鼠精子数量、畸形率、活率，生殖激素水平及睾丸形态的影响。结果：淫羊藿多糖各剂量组能够升高生精障碍小鼠精子密度和精子活率，降低精子畸形率,降低血清卵泡雌激素和黄体生成素水平，升高睾丸组织睾酮含量(P<0.01)，且各剂量组对生精功能改善作用呈剂量依赖性。形态学观察，淫羊藿多糖可改善小鼠睾丸组织的病理学损害。表明淫羊藿多糖对醋酸铅所致小鼠生精功能的损伤具有治疗作用，作用机制可能与改善或恢复生殖内分泌激素水平有关。

淫羊藿多糖 ； 醋酸铅 ； 生精障碍 ； 生殖激素

近年来，因各种损伤因素的作用导致男性精液质量呈不断下降趋势。研究表明，我国育龄夫妇不孕、不育发生率为12.5%。其中,因男性生育能力缺陷所致的不育者约占50%左右[1]，少精症和(或)弱精症等精子质量异常是导致男性不育的主要原因[2]。传统中药方剂在改善男性生殖功能方面具有较好的效果[3-4]，但由于药物种类多，成分复杂，使得中药生精的药理作用和相关机制尚未阐明，研究中药有效成分在生精障碍中的作用和机制，对男性不育药物的研发具有重要的应用价值。

淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物,其茎叶入药,辛温无毒,有坚筋骨、益精气、补腰肾、强心力等作用[5],为传统补益中药。本试验，制备获得淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，通过腹腔注射醋酸铅制备BALB/c小鼠生精障碍模型，，探讨淫羊藿多糖对生精损伤小鼠生精功能的治疗作用，为淫羊藿多糖在生精障碍中的开发和应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只SPF级雄性BALB/c小鼠，体重20±2 g，购自吉林大学实验动物中心，合格证号:SCXK(吉)2008-0005。

1.2 药物与试剂 淫羊藿，购自吉林大药房(批号：20140913)。醋酸铅：上海化学试剂厂。卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和睾丸组织匀浆睾酮(T)检测试剂盒，购自北京科美东雅生物技术有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.3 淫羊藿多糖的制备 淫羊藿100 g，洗净剪碎并研磨成粉，，按参考文献[6]方法并加以改进，以水提醇沉法制备淫羊藿多糖。料水比为1∶25，提取温度为90 ℃，提取时间为1.5h,提取次数为3次,醇沉浓度为700mL/L，得粗多糖。用氯化钙除蛋白，加活性炭脱色，透析除去无机盐，获得淫羊藿多糖。用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，以葡聚糖溶液为对照品做标准曲线，样品含糖量约为58.2 mg/g。

1.4 模型制备及动物分组处理 60只BALB/c小鼠以单纯随机抽样法分为正常组、模型组、阳性药物组以及淫羊藿多糖低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，给予其余5组BALB/c小鼠腹腔注射醋酸铅20 mg/(kg·d)，连续7 d，制备生精障碍模型。造模后，淫羊藿多糖低、中、高剂量组分别给予淫羊藿多糖50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，阳性药物组维生素E 10 mg/(kg·d)灌胃，正常组和模型组均灌胃等体积生理盐水，均每天1次，连续30 d。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 取材 末次给药24 h后全部小鼠称体重，腹主动脉取血并分离血清。右侧睾丸放入4%福尔马林固定行组织形态学检测。左侧取附睾和睾丸，其中睾丸制成匀浆，以3000 r/min离心10 min，取上清液。附睾进行精子密度、精子畸形率及精子活率检测。

1.5.2 精子密度、畸形率及活率检测 取单侧附睾，剪碎组织并放入预热至37 ℃精子营养液[7]中，37 ℃静止10 min，使精子充分游离释放，按照细胞计数法计算精子密度；另取5 μL 精子悬液与等量伊红- Y 混匀，室温下放置10 min，加盖玻片，光镜下观察，死精子呈粉红色，活精子不着色而呈胞质透明，每份标本计数200 个精子，计算精子活率；另从试管中取5 μL 精子悬液，甲醇固定5 min，2%伊红水溶液染色1 h，用高倍镜按顺序检查精子形态，头部无钩、香蕉形、胖头等形态精子判定为畸形，每只小鼠检查完整的精子1 000 个，计算精子畸形率。

1.5.3 生殖激素测定 取分离后血清及睾丸组织匀浆液，利用酶联免疫试剂盒测定血清FSH 和LH 及睾丸组织匀浆T 水平，试验步骤和方法按照试剂盒说明书完成。

1.5.4 睾丸组织形态学检测 取小鼠睾丸石蜡切片，H.E.染色，光镜观察睾丸组织形态结构。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿多糖对小鼠精子密度、畸形率及活率的影响 由表1可见，模型组小鼠精子密度和精子活率均低于正常对照组，精子畸形率高于正常组(P<0.01)。与模型组相比，淫羊藿多糖剂量组精子密度、精子活率增高，精子畸形率降低(P<0.01)。淫羊藿多糖对精液质量的改善随药物浓度的增高，作用效果也更明显，存在剂量依赖关系。阳性药物组对精子功能改善作用与200 mg/kg 淫羊藿多糖剂量组相似。

表1 淫羊藿多糖对各组小鼠精子密度、活率及畸形率影响 ±s,n=10)

注：与正常对照组比较，*P<0.01,#P<0.05,；与模型组比较△P<0.01；与50 mg/kg组比较▽P<0.01;与100 mg/kg组比较▲P<0.01

2.2 淫羊藿多糖对小鼠生殖激素的影响 由表2可见，模型组小鼠血清FSH和LH含量均高于正常组，睾丸组织匀浆T含量低于正常组(P<0.01)。与模型组相比，淫羊藿多糖各剂量组FSH和LH含量降低，睾丸组织匀浆T含量升高(P<0.01)。淫羊藿多糖对生殖激素含量的影响随药物浓度的增高，作用效果也更明显，存在剂量依赖关系。

表2 淫羊藿多糖对小鼠血清FSH、LH和睾丸组织T含量的影响

组别(mg/kg)剂量mg/kgFSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)正常对照组-3.32+0.584.87+0.969.58+0.84模型组-6.44+0.87*8.29+0.83*2.98+0.65*淫羊藿多糖组505.94+0.63*△7.72+0.61*△3.68+0.84*△1004.82+1.38*△▽6.19+0.36*△▽5.52+0.54*△▽2003.73+0.21#△▽▲5.13+0.68#△▽▲7.23+0.34#△▽▲阳性药物组103.87+0.69#△▽▲5.29+0.34#△▽▲7.88+0.62#△▽▲

注：与正常对照比较，*P<0.01,#P<0.05,；与模型组比较△P<0.01；与100 mg/kg组比较▽P<0.01;与200 mg/kg组比较▲P<0.01

2.3 淫羊藿多糖对小鼠睾丸形态影响 结果见中插彩版图1，与正常对照组相比，模型组小鼠睾丸生精小管排列紊乱，生精上皮层数明显变少，生精细胞数量变少，排列紊乱，腔内成熟精子少。淫羊藿多糖各剂量组睾丸组织形态有不同程度改善，生精小管逐渐密集，生精上皮数量不断增多，淫羊藿多糖对受损睾丸形态学改善作用随药物浓度的增高，效果也更明显，存在剂量依赖关系。

3 讨论

铅是重金属之一，长期接触铅而导致的中毒是我国慢性职业中毒的主要原因[8]。铅不仅对神经系统、造血系统、消化系统等具有毒性作用，而且对生殖系统也会造成损伤[9]，铅可以通过血-睾丸屏障沉积在睾丸生精小管及管周组织，进而对睾丸产生损伤毒害作用[10]。本研究结果证实，20 mg/kg 醋酸铅连续腹腔注射7 d可导致小鼠精子密度减少、活率降低及畸形率的增高，小鼠睾丸也出现组织学改变，导致睾丸损伤的发生。

淫羊藿是传统的药用植物，具有补肾壮阳的作用，主治阳萎早泄，腰酸腿痛，神经衰弱等，是改善男性生殖功能常用的组方药[11]。淫羊藿多糖是淫羊藿的重要有效成分，药理学研究表明，淫羊藿多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化应激损伤、延缓衰老及调节免疫的作用[12-14]。本研究利用水提醇沉法制备获得淫羊藿多糖，并检测了不同浓度淫羊藿多糖对醋酸铅致生精障碍小鼠的治疗作用。结果证实：淫羊藿多糖各剂量组均可不同程度升高精子密度，增加精子活率并降低精子畸形率，表明淫羊藿多糖对小鼠受损伤睾丸和精子的形成具有明显的治疗作用。睾丸形态学检测证实，淫羊藿多糖作用后可改善睾丸生精小管损伤的作用。提示，淫羊藿多糖具有治疗和恢复损伤生精上皮的作用。

精子的发生和正常发育是保证精子数量和质量前体条件。睾丸生精小管内保持较高浓度的T对促进精子发生具有重要作用[15]。在人体的内分泌系统中，下丘脑-垂体-性腺轴内分泌激素水平尤其是雄性生殖激素的含量，调控着精子的发生过程及睾丸局部T含量，这其中FSH、LH的含量及变化对精子的发生及质量的影响最为重要。FSH、LH 为垂体分泌的糖蛋白类激素，FSH可与其位于生精小管的支持细胞膜上的受体结合，促进或增加性激素结合蛋白的产生，使睾丸组织中T浓度维持在较高水平。LH则具有刺激睾丸间质细胞合成和分泌T的作用，不仅可提高睾丸局部T含量，而且可与FSH协同作用促进精子的成熟，并与精子的活动力有关[16]。有研究证实，FSH和LH水平可作为睾丸生精功能的预测指标，如果FSH明显增高，提示睾丸生精功能严重受损，如果LH升高越明显提示睾丸受损可逆性越差[17]。

本试验中，模型组小鼠睾丸组织匀浆T含量降低，结合精液质量结果，提示铅中毒后可影响精子产生，造成生精功能障碍。同时，血清FSH、LH含量增高，提示T含量降低可通过负反馈机制作用于丘脑-垂体-性腺轴，进而促进FSH、LH分泌增多，使血中两种生殖内分泌激素含量升高。淫羊藿多糖干预后，睾丸组织T含量增高，而且睾丸形态损伤也明显好转，血中FSH、LH含量降低。提示，淫羊藿多糖可刺激生精上皮再生，减轻睾丸组织损伤，升高睾丸局部T含量，恢复丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控作用而提高精子数量和质量，从而治疗因铅中毒引发的生精障碍。

综上所述，淫羊藿多糖能有效治疗因醋酸铅导致的生精障碍，提高精子数量和活率，降低精子畸形率，提高睾丸局部T含量，降低血清FSH、LH含量，并能够减轻或恢复受损睾丸组织形态，从而改善生精功能。

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2015-09-09

赵东海(1975-),男,副教授，博士，从事生殖病理研究工作，E-mail：zdh1027@sina.com

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0529-6005(2016)10-0029-03