食品中A.hydrophila分析方法研究

罗红梅

摘要：A.hydrophila原为水生细菌，广泛存在于淡水，海水及各河海交会口，故水产食品常可分离出此菌。除了水产品外，各种生肉类和内脏、即食肉类和生菜沙拉等此菌的检出率为5.15%和22.83%。此外，生牛奶、鲜乳、乳酪和冰淇淋也可分离出A.hydrophila。文章对食品中的A.hydrophila分析方法进行了研究。

关键词：食品；A.hydrophila分析方法；水生细菌；水产食品；食品检测 文献标识码：A

中图分类号：TQ317 文章编号：1009-2374（2016）30-0067-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.30.032

1 Aeromonashydrophila基本特性

Aeromonashydrophila属于弧菌科（Vibrionaceae）Aeromonad属，为革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌，直径0.3～1.0μg/mL，长1.0～3.5μg/mL，具单一极鞭毛，有运动性。此菌为异营性（heterotrophic），能产生oxidase及catalase，并可利用某些碳水化合物产生酸或同时产气（CO2、H2），亦会水解esculin。

2 传统分析方法

2.1 利用培养基分离

早期Aeromonas菌属的分离大多采用分离肠内菌属或海洋弧菌属的培养基，由于A.hydrophila具有lactose（+）及lactose（-）的菌株，而用以分离肠内病原菌的培养基中的碳水化合物成分，常会抑制Aeromonas菌属的生长。因此，一般用分离肠内菌的培养基MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar等并不适用。近年来，许多学者分别针对食品或水等不同的来源而发展出适用的培养基，且培养基中皆添加ampicillin来抑制其他杂菌的生长，更有利于Aeromonas菌属的回收。例如在临床上，对于此菌的分离大多采用5%sheepbloodagar，另外添加1030g/mL的ampicillin，配合此菌产生β-溶血素的能力来区分，皆较以往分离肠内菌的培养基佳。且由于A.hydrophila氧化酵素反应常与培养基成分有关，而用sheepbloodagar并不会对此反应造成干扰。对于食品中此菌的分离，同样可以ampicillin（10g/mL）作为抑制剂，starch则是用以区分的受质，当菌落形成后，加入Lugolsiodinesolution，菌落为amylase（+）者，即为A.hydrophila。此方法已被广泛应用于食品中A.hydrophila的分离，然而SA无法区分A.hydrophila与A.caviae。

另外，Oxoid公司将XLD（xyloselysinedeoxycholate）修饰后发展出RyansAeromonasmediumbase，再添加5μg/mL ampicillin，专用以分离Aeromonas及Plesiomonas菌属，前者为深绿色菌落，后者则为蓝灰色菌落（OxoidproductcodesCM833）。以SA、SGAP（starchglutamateampicillinagar）及RAM（RyansAeromonasmedium）来比较食品中A.hydrophila的分离率，结果三种选择性培养基皆有93%以上的分离率，并无显著差异。

Tsai和Chen（1996）以三种选择性培养基SA、Bloodampicillinagar（BA）及OxoidAeromonasagar（OA）分离水产品中A.hydrophila，结果以BA分离出此菌的比率最高，SA及OA所得的典型菌落，经生化测试后，许多菌落为A.sobria或A.caviae，显示此两种选择性培养基对A.hydrophila、A.caviae以及A.veronii辨识度较差，可能是因为OA中的ampicillin浓度较低所致。

水中A.hydrophila的分离则大多采用，先将样品增殖培养（enrichment）后，以膜过滤，再置于ADA上培养。而Holmes及Sartory（1993）以ADA、XAA、RAM及BIBA比较146个水样中Aeromonasspp.的分离率，结果以ADA及RAM回收率较好。

2.2 利用生化特性鉴定

A.hydrophila的鉴定方法一般是参考BergeysManualofSystematicBacteriology进行各种生化测试，例如oxidase、catalase、starchhydrolysis、fermentationofglucose、mannitol、fructose、galactose、dextrin及esculin水解等。然而传统生化测试有其困难点，A.hydrophila培养在不同培养基，对相同生化测试，不一定有相同的反应，且耗费很多时间配制培养基，需要进行繁复的测试，因此商业上发展了鉴定套组来加以确认。于鉴定套组方面，可以通过比较API20E、APIRE及APINFT等套组，显示API20E鉴定的正确率达100%，APIRE及APINFT分别只达77%及87%的正确率。于实际应用时，API20E亦可准确鉴定出牡蛎、临床及环境的A.hydrophila分离株，但是由于许多环境分离株未列入API资料档，因此以API20E鉴定环境分离株时，应同时对一些重要生化反应，再辅以传统生化测试方法以

确认。

而对于API20E、APINE及Microbact24NE做比较，可以发现API20E鉴定的正确率只达72.5%，而APINE及Microbact24NE的正确率则皆达97.5%。另外，也可以GNMicroplate（BIOLOG，Hayward，Calif）测试60株临床分离株（A.hydrophila、A.sobria及A.caviae各20株）对于95种碳源的氧化能力，认为此套组能有效地鉴定出临床的Aeromonas分离株。在传统鉴定中，利用选择性培养基分离出可疑菌落，以生化测试确认；而鉴定套组只能缩短生化测试的时间，仍需辅以传统方法确认。

3 快速分析方法

由于A.hydrophila的传统分析方法，除了选择性培养基多种选择外，各种生化套组鉴定时仍需辅以传统生化测试，耗时费力，无法因应工业界快速得知结果的要求。人们极欲发展此菌的核酸探针及免疫分析的快速分析方法。

3.1 核酸探针

A.hydrophila共含三个DNAhybridizationgroup，即HG1、HG2、HG3，由环境中分离的以HG3为主，病患检体中分离的菌株，则以HG1为主。利用16SrRNA为引子，以PCR分析鉴定环境中的菌数与杂交的相关性，检测67件样品，显示在海水（22/67）、溪水（3/67）、临床检体（0/67）的检出率不高，且与其他菌株有交叉反应。另外，探讨由人的粪便分离Aeromonasspp.菌株的表现型与DNA的相关性，发现基因分类与表现型的鉴定有时检测结果不一致，其建议当表现型及一些生化测试不具特异性时，需辅以基因的测试。为了发展核酸探针以快速分析A.hydrophila，必须先寻找A.hydrophila所特有的基因。从水域中的A.hydrophila找到其肠毒素基因，进一步发现A.hydrophila的肠毒素与霍乱毒素两种基因的DNA核酸序列相似，因此不适合当特异性的探针。

利用A.hydrophila溶血基因建立了长度为48个寡核酸的探针，并另外由霍乱弧菌毒素基因建立了长度为34个核酸（C1）及19个寡核酸（C2）的探针，其首先以A.hydrophila溶血基因探针，利用菌落杂交法，找出呈阳性反应的A.hydrophila菌落，抽取其染色体DNA后，再用南方转移，再分别以霍乱毒素基因片段C1、C2为核酸探针进行DNA杂交法，发现部分菌株与霍乱弧菌毒素探针（C1）有阳性反应，但对C2探针则为阴性反应，显示霍乱弧菌毒素基因及水域菌株的溶血素基因的核酸序列相似。因此目前利用A.hydrophila溶血基因片段所建立的核酸探针法尚无法克服伪阳性反应的问题。利用randomlyamplifiedpolymorphicDNA（RAPD）技术分类7株A.hydrophila菌株，经PCR产生DNA，以SmaⅠ限制产生指纹图谱，发现此7株菌在RAPD没有一致性的片段，显示其基因变化大。

3.2 免疫分析法

免疫分析法包含免疫沈淀法、免疫电泳法、免疫荧光法、放射性免疫分析法（RIA）和酵素免疫分析法（EIA），均已用于临床及病原菌的抗原测定。放射性免疫分析法和酵素免疫分析法具有高敏感性。

4 结语

目前对A.hydrophila的分离与鉴定尚未标准化。早期Aeromonas菌属的分离大多采用分离肠内菌属或海洋弧菌属的培养基，然而如MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar中的碳水化合物会抑制部分A.hydrophila的生长，并不适用于分离。近年来，许多学者分别针对病人检体、食品或水等不同来源的菌株而发展相关的培养基，且均利用ampicillin来抑制其他杂菌的生长。然而不论何种选择性培养基，其上可疑菌落均必须经过生化鉴定，方能确定为A.hydrophila。

参考文献

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