航天紫花苜蓿叶蛋白正交提取工艺模式的研究

1杨丽娟，1蒲晓亚，1杜旭升, 2王廷璞*，2薛志强

（甘肃省产品质量监督检验东部分中心2，天水师范学院1，甘肃 天水 74 001;）

航天紫花苜蓿叶蛋白正交提取工艺模式的研究

1杨丽娟，1蒲晓亚，1杜旭升, 2王廷璞*，2薛志强

（甘肃省产品质量监督检验东部分中心2，天水师范学院1，甘肃 天水 74 001;）

优选航天紫花苜蓿叶蛋白的提取工艺条件，对不同品系的苜蓿叶蛋白进行差异性分析。用单因素极差分析，280nm紫外光测测定并计算提取率，L9 (33) 正交实验设计确定最佳提取工艺。 结果表明，通过单因素实验确定的各因素影响能力大小为：pH>浸泡时间>料液比>温度，正交实验最佳组合为A2B1C1。结果中三得利（兰州）对照和MA-7中叶蛋白的含量相对较高，分别为21.91%和19.42%。

航天；紫花苜蓿；叶蛋白；正交设计

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)又名苜蓿，紫苜蓿，素有“牧草之王”的美称。紫花苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，全国各地均有种植，但主要分布在西北和华北地区[1]。苜蓿有许多营业价值，其粗蛋白含量通常在22%左右，含有20种以上的氨基酸[2]。航天育种紫花苜蓿各方面因素均高于普通紫花苜蓿，本实验对航天紫花苜蓿中叶蛋白进行正交提取工艺设计，优选出最佳提取方案，为今后的我国航天紫花苜蓿研究做了一些借鉴。

1 、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

航天紫花苜蓿（采自天水市国家级高新农业园区神州绿鹏航天育种基地）。

1.1.2 仪器

UV-9200型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、HJ-3型恒温磁力搅拌器（金坛市科兴仪器厂）、PHS-3D型精密PH计（上海精密科学仪器有限公司）、TDZ5-W型多管架自动平衡离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、TG16-W型微量高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、AUY220型电子天平、电热恒温水浴锅、漩涡混合器等。

1.1.3 试剂

磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸铵、牛血清白蛋白，其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制及曲线绘制

准确称取25mg牛血清白蛋白，用无离子水定容至25mL，配制成1mg/mL的溶液[3]。另取12支试管，配制标准溶液梯度为0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL，平行做两份。于280nm下测光吸值，以牛血清白蛋白的含量为横坐标，OD280nm值为纵坐标，做出牛血清白蛋白标准曲线，得其回归方程为：Y=0.3109X－0.0071，R2=0.9984。

1.2.2 单因素实验

通过查阅资料和单因素预实验，初步拟选出影响苜蓿叶蛋白提取率的主要因素有：pH、温度、料液比、浸泡时间，进行以下实验[4]。

称取5份样品，每份2g，加入石英砂研磨，按料液比1∶7加入pH=5.0、6.0、7.0、8.0、9.0缓冲液[5]，调pH=7.0，浸泡40min。40min后，在多管架自动平衡离心机4000r/min离心10min，取上清液于两个5mL离心管中，在微量高速离心机中12000r/min离心5min。将上清液转入另两个离心管中，按照硫酸铵饱和度50、60、70、80%分级分离苜蓿叶蛋白，将每次所得蛋白再溶解，总共体积为4mL，装入同一离心管中，吸取0.4mL加入新的离心管中，再加入3.6mL的pH=7.0的缓冲液。经测定OD280后固定pH，再依次选取15、20、25、30、35℃恒温水浴加热，1∶4、1∶7、1∶10、1∶13、1∶16 mL/g料液比，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h浸泡时间，逐次选取一个单因素后再固定，直至选取结束。

1.2.3 不同品系航天育种紫花苜蓿叶蛋白的提取

按照前面单因素和正交设计所确定的工艺来提取紫花苜蓿叶蛋白。在待测的40个样品中，选择长势较好的26个样品，清洗后晾干，准确称取2.00g，研磨，装入写有标签的50mL的离心管，按料液比1:7加入Ph=5.0的缓冲液14mlL，浸泡2h。平衡后，在多管架自动平衡离心机4000r/min离心10min，取上清液于两个5mL离心管中，微量高速离心机中12000r/min离心5 min，将上清液转到另两支离心管中，按硫酸铵饱和度50%、60%、70%、80%分级分离苜蓿叶蛋白，将每次所得蛋白再溶解，使总共体积增至4mL，装入同一离心管中，吸取0.4mLz转入新的离心管中，再加入3.6mL的 pH=5.0的缓冲液，测其OD280。

2 、结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

牛血清白蛋白标准曲线，见图1所示。

图1 牛血清白蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of BSA

由上图可知，牛血清白蛋白在0-1.0mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 不同pH值对苜蓿叶蛋白的提取率的影响

表1 不同pH值对提取效果的影响Tab.1 The different pH for the extraction effect

由表1可知，苜蓿叶蛋白的提取率在pH=5.0、6.0和7.0时提取率较高，且在pH=6.0时提取率最高，结合实验时的观察记录，在pH=5.0和pH=6.0时所提的叶蛋白含的绿色粉末非常少，故pH在6.0时提取效果较好。

2.2.1 不同温度对苜蓿叶蛋白的提取率的影响

表2 不同温度对提取效果的影响Tab.2 The different temperature for the extraction effect

由表2可知，温度对提取率的影响不显著，在30℃时提取率最小，所以一般选择室温即可，而且加热会增加实验的成本，加热将耗费大量的电。因此不选择加热或保温，一般在室温下进行。

2.2.3 不同料液比对苜蓿叶蛋白的提取率的影响

表3 不同液料比对提取效果的影响Tab.3 The different liquid to solid ratio for the extraction effect

由表3可知，苜蓿叶蛋白的提取率在料液比1:7时最大，和参考文献一致[6]。随着料液比增大提取率不再增加，缓冲液加入太少，叶蛋白不能充分溶解，加缓冲液加入太多，又会增加提取体积，加大工作量，降低生产效率。故料液比在1:7～1:13时最佳。

2.2.4 不同浸泡时间对苜蓿叶蛋白的提取率的影响

表4 不同浸泡时间对提取效果的影响Tab. 4 The different macerating time for the extraction effect

由表4可知，在浸泡时间为0.5h、2.0h和2.5h下的提取率较高，从经济的角度考虑，0.5h的提取率和其他的水平差异不太显著，故选择浸泡时间为0.5h较为理想。

2.3 正交实验的结果与分析

将优选后的pH、料液比、浸泡时间等三种因素，采用L9(33)正交表，进行实验设计，并通过标准曲线计算提取液中蛋白的含量，其结果见表5-7所示[7]。

表5 正交提取实验因素水平表Tab. 5 The factor level table of orthogonal extraction

表6 正交提取实验结果分析表Tab.6 The result analysis table of orthogonal extraction实验号

表7 正交提取实验方差分析表Tab.7 The variance analytical table of orthogonal extraction

从上表中可以看出，影响蛋白得率的因素主次顺序为：料液比>pH>浸泡时间，各因素差异均呈显著（P＜0.05）[8]。其正交实验最佳提取工艺为：A2B1C1，即浸泡时间2.0h、料液比1:7、pH=5.0。

4 不同品系航天育种紫花苜蓿叶蛋白的提取结果

不同品系航天育种紫花苜蓿叶蛋白的提取结果见图2所示。

图2 不同品系苜蓿叶蛋白提取率Fig. 2 Alfalfa leaf protein extraction rate of different strains

经过对不同品系航天育种紫花苜蓿叶蛋白的测定可知，三得利（兰州）和MA-7中所提的蛋白含量相对较高，分别为21.91%和19.42%。

3 、结 论

在正交实验中，pH并不是影响实验结果的最大因素，而料液比影响则比较显著，说明在各因素共同作用时，与单因素的情况不同，存在一定的协同效应。提取苜蓿叶蛋白的方法多为酸热法，即通过调节苜蓿叶蛋白的等电点和加热，使蛋白质变性以利于测定，本实验使用硫酸铵沉淀蛋白，在蛋白质不变性的情况下提取到有活性的蛋白质，操作简单，花费较少。通过正交提取实验，得到了航天育种紫花苜蓿叶蛋白的最佳提取工艺为：浸泡时间2.0h、料液比1:7、pH=5.0，提取不同品系航天育种紫花苜蓿叶蛋白后发现，三得利（兰州）和MA-7叶蛋白的含量相对较高，分别为21.91%和19.42%。本实验为我国航天育种紫花苜蓿的深层次开发和利用提供了一定的理论参考。

[1] 包爱科,王强龙,张金林, 等.苜蓿基因工程研究进展[J].分子植物育种,2007,5,:160-168.

[2] 李富娟,玉永雄.苜蓿蛋白质及影响苜蓿粗蛋白含量的主要因素[J].牧草科学,2006,2:6-7

[3] 许淑芳,朱江,刘邻渭,等.考马斯亮兰G-250法测定苹果浓缩汁生产中的蛋白含量[J].饮料工业,2005,8:45-46.

[4] 安建平,王廷璞.生物化学与分子生物学实验技术教程[M].兰州大学出版社,2005,7.

[5] 张春兰.莜面与其他面粉蛋白质含量的比较[J].现代面粉工业,2010,3:41-42.

[6] 姜健,杨宝灵,王冰.苜蓿不同部位的氨基酸组成及含量分析[J].安徽农业科学,2008,36(29):12643-12649.

[7] 侯银环,辛海量,徐燕丰.正交实验优选马齿苋提取物制备工艺研究[J].药学服务与研究.2008,8 (3):202-203.

[8] 薛香,梁云娟,郜庆炉.农业科研中应用Excel 进行方差分析的方法[J].现代化农业,2009,8:48-50.

Study on Orthogonal Design Mode of Leaf Protein from Space Breeding Alfalfa

YANG Lijuan2,PU Xiaoya2,WANG Tingpu1＊, XUE ZhiQiang1
(Product Quality Supervision and Inspect Center of The Eastern Branch of Gansu2, Tianshui Normal University1, Tianshui Gansu, 741001, China)

To select the alfalfa leaf protein extraction process conditions, To different strains of alfalfa leaf protein use difference analysis. After use the single factor analysis of range, measuring leaf protein extraction rate in 280nm by uv spectrophotometry, identify the best extraction technology by the result of L9(33) orthogonal experiment design. The results show that through the single factor to determine the influence of various factors are pH > macerating time > Liquid to solid ratio >temperature,the best combination of orthogonal test is A2B1C1. Conclusion: Through the experiments of San Deli (Lan Zhou) contrast and MA- 7 extracted relatively high leaf protein, 21.91% and 19.42% respectively.

space flight; alfalfa; leaf protein; orthogonal design