超声辅助提取野西瓜藤中葫芦素B工艺的优化

赵春燕,刘钰莹,,马 越,赵晓燕,张 超,*

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866; 2.北京市农林科学院蔬菜研究中心,果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室,农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,农业部都市农业(北方)重点实验室,北京 100097)



超声辅助提取野西瓜藤中葫芦素B工艺的优化

赵春燕1,刘钰莹1,2,马 越2,赵晓燕2,张 超2,*

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866; 2.北京市农林科学院蔬菜研究中心,果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室,农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,农业部都市农业(北方)重点实验室,北京 100097)

采用超声辅助法从野西瓜藤中提取葫芦素B,研究料液比、乙醇体积分数、超声时间和超声温度对野西瓜藤中葫芦素B得率的影响,并以葫芦素B得率为响应值,采用响应面分析方法优化葫芦素B提取工艺。结果显示:超声处理温度对葫芦素B得率影响最大,其次是乙醇体积分数和超声时间,当超声温度80 ℃、超声时间30 min、乙醇体积分数75%时,葫芦素B得率最高,可以达到84.7%,提取量为0.168 mg/g。

野西瓜,藤,超声辅助,葫芦素B,响应面法

葫芦素B是四环三萜类化合物,是葫芦素家族中含量最丰富的成员[1-2],具有保护肝、消炎、抗肿瘤、提高机体免疫力等功能[3-5]。近年来,从植物资源中提取葫芦素的方法有乙醇回流法、超临界CO2萃取法、超声辅助法等[6-7],其中超临界CO2萃取法从甜瓜蒂中提取葫芦素B的得率为16.5 mg/g[8];乙醇回流法从甜瓜蒂中提取葫芦素B的得率为10.7 mg/g[9];超声辅助法从甜葫芦中提取葫芦素B的得率为7.98 mg/g[10]。比较上述3种提取成本和产品得率,超声辅助提取法具有操作方便、省时、高效等特点,在成本与效率之间基本上达到平衡点。

野西瓜(Citrulluscolocynthis)是一种生活在沙漠地区的攀缘藤草本植物,在我国新疆、内蒙古等地有少量分布,是维吾尔族传统用药之一,具有消炎、止痛、解毒等功能[11-12]。本课题组首次检测发现野西瓜藤(包括蔓和叶)含有葫芦素B,含量达到0.198 mg/g。野西瓜藤资源丰富,生物产量大,且易于获取,但是目前是农业废弃物,直接抛洒在田间[13]。鉴于此,研究考察超声辅助提取工艺对野西瓜藤中葫芦素B得率的影响,采用单因素实验结合响应面分析的方法优化超声辅助提取工艺参数,以期为野西瓜藤资源的充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野西瓜藤 北京蔬菜研究中心农场采收;葫芦素B标准品 四川省维克奇生物科技有限公司;无水乙醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱仪，Agilent 1260(配有四元泵及自动进样器、DAD 检测器) 美国安捷伦公司;高速万能粉碎机，FW100 天津市泰斯特仪器有限公司;数控超声波清洗器，KQ-500DE 昆山市超声仪器有限公司;电子天平，PL3002 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;布氏漏斗抽滤装置 成都蜀牛科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葫芦素B标准曲线的绘制 称取葫芦素B标准品0.2 mg,配制成质量浓度为0.2 mg/mL标准储备液。分别量取该标准储备液5、10、25、50和75 μL,配制成质量浓度分别为0.01,0.02,0.05,0.1,0.15 mg/mL的标准溶液,以葫芦素B的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:XBridge-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温25 ℃;流动相:A相:纯水,B相:乙腈;梯度洗脱:0～30 min,50% B;30～45 min,50%～100% B;45～60 min,100%～50% B;流速1 mL/min;检测波长228 nm[14]。

1.2.3 样品中葫芦素B含量的测定 在野西瓜成熟后,将野西瓜藤在60 ℃烘干至水分含量低于10%,使用FW100高速万能粉碎机粉碎30 s,收集通过20目筛网的粉末,精确称量干粉5 g,放入100 mL烧杯中,加入一定体积比的乙醇水溶液,封口膜封住烧杯,按一定的超声条件(料液比、溶剂体积分数、超声时间、超声温度)提取葫芦素B,布氏漏斗抽滤后过0.45 μm滤膜,采用HPLC方法测定葫芦素B峰面积,根据标准曲线计算样品中葫芦素B的含量。葫芦素B得率计算公式为:

式中:e:葫芦素B得率,%;c:样品溶液中葫芦素B质量浓度,mg/mL;v:加入的乙醇体积,mL;m:样品中总葫芦素B含量,mg。

1.2.4 单因素实验 在固定温度为60 ℃、乙醇体积分数为70%、超声时间为20 min的条件下,考察不同料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)对葫芦素B得率的影响;固定料液比为1∶14时,乙醇体积分数为70%、超声时间20 min条件下,考察不同超声温度(40、50、60、70、80 ℃)对葫芦素B得率的影响;固定料液比为1∶14时,超声温度为80 ℃、超声时间20 min条件下,考察不同乙醇体积分数(50%,60%、70%、80%、90%)对葫芦素B得率的影响;固定料液比为1∶14时,超声温度为80 ℃、乙醇体积分数为90%条件下,考察不同超声时间(10、15、20、25、30 min)对葫芦素B得率的影响。

1.2.5 响应面实验设计 综合单因素实验结果,选取对葫芦素B提取有显著影响的乙醇体积分数、超声时间、超声温度为因素,运用Design-Expert软件设计实验[15-16],分析并确定最佳提取工艺条件。

1.3 数据处理与统计

实验所有数据均有三次重复,计算平均值和标准偏差。使用统计分析软件DPS v7.05进行处理,Ducan’s新复极差法进行显著性分析(p≤0.05)。采用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析,图像绘制采用Origin 8.0软件(美国Origin Lab Corporation公司)。

2 结果与分析

2.1 葫芦素B标准曲线绘制

图1显示葫芦素B含量与峰面积呈线性关系。其回归方程为Y=16347X-21.77843,相关性R2=0.9997,葫芦素含量在0～0.20 mg/mL范围内线性关系良好。

图1 葫芦素B标准曲线Fig.1 Standard curve of cucurbitacin B

图2 超声对得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extraction on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.2 超声波辅助提取对葫芦素B得率的影响

野西瓜藤中葫芦素B的含量为0.198 mg/g,低于甜瓜蒂和天花粉中的葫芦素B含量,但是野西瓜藤的生物产量是果实的20～300倍,所以野西瓜藤是葫芦素B的良好来源。图2比较超声波辅助提取对葫芦素B得率的影响,处理的料液比为1∶10、温度为60 ℃条件下,用70%乙醇提取20 min,超声处理显著增加葫芦素B的得率,达到未超声处理的5倍。原因在于超声波的空化作用、热效应、机械作业加速细胞壁的破碎使胞外溶剂容易进入细胞内[17],从而促进葫芦素B溶出,得率提高。

2.3 料液比对葫芦素B得率的影响

图3为料液比对葫芦素B得率的影响,葫芦素B得率随着料液比的增大而增加,得率从48.9%上升到62.3%,这是由固、液相之间的浓度差而决定的。料液少,两相间的浓度差小,从而传质推力小,随着溶剂的增加,导致传质推力的提高,使得率上升,但从显著性分析来看,1∶14与1∶16差异不显著(p>0.05),因此从生产成本考虑料液比1∶14为宜。

图3 料液比对得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.4 超声温度对葫芦素B得率的影响

图4为超声温度对葫芦素B得率的影响,结果显示野西瓜藤中葫芦素B的得率随着超声温度增大而增加,从43.2%上升至在80 ℃时为54.8%达到最大值。这是由于温度升高,溶液内分子运动剧烈,反应速率增大,导致得率的增加,在80 ℃时,得率最大,考虑到超声仪器的实际承受能力(最大为90 ℃),选择80 ℃为最佳提取温度。

图4 超声温度对得率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.5 乙醇体积分数对葫芦素B得率的影响

如图5,结果表明,在实验范围内,葫芦素B得率随着乙醇体积分数的增加而增大,得率从40.6%上升至65.6%,且在乙醇体积分数为90%时,提取液中葫芦素B含量最高,提取效果最佳。

图5 乙醇体积分数对得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.6 超声时间对葫芦素B得率的影响

图6可以看出,葫芦素B的得率随着超声时间的增加而逐渐增大,从52.56%上升至63.42%并在30 min时的得率为63.42%达到最大值,这可能是由于随着超声时间的延长,样品中大部分葫芦素B溶于乙醇中,从而使得得率逐渐增大。因此,选取30 min为葫芦素B的最佳提取时间。

图6 超声时间对得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.7 回归模型的建立及统计分析

响应面优化实验结果见表1。采用软件Design-Expert8.0对所得数据进行回归分析,分析结果见表2。

表1 Design-Export实验设计结果

Table 1 Experiment result of Design-Export

实验号ABC葫芦素B得率(%)100040632000530630005061401-16948510144026011887570-1150148-1-105460910-13931101-104544110005582120-1-1564313-110460914-10-1440915-1014763161106581170005107

表2 拟合二次多项式模型的方差分析

Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

项目平方和df均方F值p值模型21×10-1924×10-2113000021∗∗A29×10-4129×10-401400710B56×10-2156×10-2266200013∗C78×10-3178×10-337600930AB32×10-2132×10-2154000057∗AC32×10-5132×10-5001600090∗∗BC22×10-2122×10-2105700140∗A258×10-2158×10-2278600012∗∗B239×10-2139×10-2188100034∗∗C219×10-3119×10-309603600残差15×10-2720×10-3失拟项13×10-2343×10-3122501700误差14×10-3435×10-4总离差23×10-116

由方差分析表2可以看出模型的p=0.0021<0.01,说明该模型极显著,因此,这种实验方法是可靠的。方差的失拟项表现不显著p=0.1700>0.05,说明表面模型回归拟合较好各因素值与响应值之间的关系可以用此模型来函数化,决定系数R2=0.9747说明葫芦素B提取量的结果与模型回归值有较好的一致性[18]。由表2中模型系数的显著性检验数据可知,超声温度的一次项对葫芦素B得率的影响达到显著水平(p<0.05),二次项的影响呈现极显著水平(p<0.01),乙醇体积分数的一次项均未达到显著水平,而乙醇体积分数的二次项则达极显著水平(p<0.01)。A与B交互作用显著,B与C交互作用显著,A和C交互关系极显著,表明各影响因素与响应值的关系中,二次项和交互项对响应值有影响。由F值可知,各因素对葫芦素B提取得影响排序为超声温度(B)>超声时间(C)>乙醇体积分数(A)。各因素对葫芦素B得率的影响不是简单的线性关系,利用软件对表1中实验数据进行多元回归分析,得到各因子对葫芦素B得率影响的二次回归模型:

Y=50.22+0.27A+7.96B+2.63C-7.22AB-0.28AC+0.64BC-9.83A2-1.25B2+3.36C2

式(1)

由响应面模型绘制出响应面分析图,图7可以看出,当乙醇体积分数一定时,随着超声时间的增大葫芦素B的得率呈逐渐上升的趋势;当超声时间不变时,葫芦素B得率随着乙醇体积分数增加而增大。由Design-Expert 软件对二次项回归方程进行求解,可得药西瓜蔓中葫芦素B得率的优化值为:超声温度为79.37 ℃、超声时间为29.51 min、乙醇体积分数74.54%,葫芦素B得率为81.4%。为方便实验操作将最优化条件取整数为:超声温度80 ℃、超声时间30 min、乙醇体积分数75%,在此条件下,葫芦素B的提取量为0.168 mg/g,得率为84.7%。

图7 乙醇体积分数与超声时间对响应值的影响Fig.7 Effect of ultrasonic temperature and time on extraction rate of Cucurbitacin B

3 结论

研究以葫芦素B得率为响应值,通过单因素实验及响应面分析法探究野西瓜藤中葫芦素B的最佳提取工艺,结果显示超声处理温度对葫芦素B得率影响最大,其次是乙醇体积分数和超声时间,当超声温度80 ℃、超声时间30 min、乙醇体积分数75%时,葫芦素B得率最高,可以达到84.7%。因此最佳提取条件为:超声温度80 ℃、超声时间30 min、乙醇体积分数75%,在此条件下,葫芦素B得率为84.7%,提取量为0.168 mg/g。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of cucurbitacin B from watermelon(Citrulluscolocynthis)vine

ZHAO Chun-yan1,LIU Yu-ying1,2,MA Yue2,ZHAO Xiao-yan2,ZHANG Chao2,*

(1.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;2.Beijing Vegetable Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences;Beijing Key Laboratory of Fruitsand Vegetable Storage and Processing;Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China), Ministry of Agriculture;Key Laboratory of Urban Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China)

CucurbitacinBwasextractedfromwatermelon(Citrullus colocynthis)vinesbytheultrasonic-assistedextraction.Theultrasonic-assistedextractionwasoptimizedbythecombinationofthesingle-factorexperimentandresponsesurfacemethodology.TheresultsshowedthattheultrasonictemperaturewasthekeyfactoraffectingthecucurbitacinBextractionrate,whiletheethanolconcentrationandultrasonictimeshowedlessinfluenceontheextractionrate.TheextractionrateofthecucurbitactinBreachedto84.7%whentheethanolconcentrationwas75%withtheultrasonictemperatureof80 ℃for30min.

Citrullus colocynthis;vine;ultrasound-assistedextraction;cucurbitacinB;responsesurfacemethodology

2016-03-21

赵春燕(1966-)，女，博士，副教授，研究方向：农产品深加工，E-mail:zhaochunyan108@163.com。

*通讯作者:张超(1978-)，男，博士，副研究员，研究方向：果蔬深加工，E-mail:zhangchao@nercv.org。

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-26)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140204)；果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室专项(Z141105004414037)。

TS217.1

B

1002-0306(2016)19-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.030