功夫菊酯高效降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

王彦辉，杜良伟，李红红，封国君，罗 韬

(1.广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，广西作物病虫害生物学重点实验室， 广西 南宁 530007；2.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530007，3.广西大学农药与环境毒理研究所，广西 南宁 530005)



功夫菊酯高效降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

王彦辉1，杜良伟2*，李红红3，封国君3，罗 韬3

(1.广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，广西作物病虫害生物学重点实验室， 广西 南宁 530007；2.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530007，3.广西大学农药与环境毒理研究所，广西 南宁 530005)

以功夫菊酯为目标，从生产拟除虫菊酯农药厂污水处理口的淤泥里筛选高效降解真菌，并对降解菌进行鉴定和降解特性研究。经形态学和18S rDNA测序鉴定，该高效降解真菌为青霉菌(Penicilliumsp.)。采用色谱法对降解特性进行研究，结果表明：在pH=7.0，温度30 ℃，底物浓度50 mg/L时降解效果最好，7 d时对功夫菊酯降解率达到83.90 %；该菌株还可降解溴氰菊酯、高效氯氰菊酯。

功夫菊酯；生物降解；青霉菌；降解特性

农药产品在现代农业生产中发挥着重要作用，但同时其自身对人类健康及环境安全具有一定的威胁性，因此，低效、剧毒性以及高残留农药产品逐步被高效、低毒性、低残留农药产品所替代。拟除虫菊酯农药是作为目前最有发展前景的杀虫剂，常用于防治一系列农业和卫生害虫，其具有高效低毒低残留等特性，使用量仅次于有机磷杀虫剂[1]。由于拟除虫菊酯农药对光和热稳定的特点，在环境中半衰期较长，且长期大量的使用势必造成环境中农药残留蓄积，进而威胁到人类健康[2]。最近的研究表明长期大量接触拟除虫菊酯农药有致癌的风险[3-5]，因此，研究拟除虫菊酯农药残留降解特性对农业安全生产、环境保护及人类健康均具有重要意义。

微生物降解是一种环保无污染的农药消除方式，近几年有关拟除虫菊酯农药降解菌的相关研究报道涉及芽孢杆菌(Bacillussp.)[6]、寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)[7]、金色链霉菌(Streptomycesaureus)[8]、枝孢菌(Cladosporiumsp.)[9]、苍白杆菌(Ochrobactrumlupine)[10]、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)[11]、假单胞菌(Pseudomonassp.)[12]、红球菌(Rhodococcussp.)[13]等方面，其中大部分降解菌是细菌，关于真菌降解菌的报道相对较少。

本研究以功夫菊酯为目标，从生产拟除虫菊酯农药厂污水处理口的淤泥里筛选高效降解真菌，并对降解菌进行鉴定和降解特性研究，旨在丰富拟除虫菊酯农药降解菌资源库，为其在生物修复中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

功夫菊酯标准品(98.00 %)；溴氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、高效氯氰菊酯原药(广西田园生化股份有限公司)，使用前甲醇溶解配制成储备液，按照所需要浓度添加到培养基中；色谱纯乙腈(美国Fisher公司)；TIANampFungal DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；10×PCR Buffer、dNTP mixture、Taq聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；其余均为国产分析纯试剂。

1.2 培养基

无机盐培养基(MSM)：NH4NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO40.025 g，微量元素1 mL，H2O 1000 mL，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

PDA培养基(中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司生产)。YPD培养基：酵母膏10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL，115 ℃灭菌15 min。以上培养基灭菌后加入功夫菊酯储备液使其终质量浓度为20、50和100 mg/L。

1.3 仪器设备

Waters液相色谱仪(美国waters公司)；恒温摇床(上海智城分析仪器制造)；GNP-9160型隔水式恒温培养箱(上海慧泰仪器制造有限公司)；SIGMA1-14离心机(德国SIGMA公司)；PCR仪(Bio-Rad公司)；DYY-7B电泳仪(北京六一仪器厂)；超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司)；pH计(上海雷磁有限公司)；尼康光学显微镜(尼康仪器上海有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国密理博公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 分离与富集降解菌 取5.0 g活性淤泥加入50 mL的含50 mg/L功夫菊酯无机盐培养基中，置于30 ℃恒温摇床中180 r/min振荡培养。7 d后取5 mL的该培养液加到新的含50 mg/L功夫菊酯无机盐培养基中。按照上述操作连续培养6次。最终的培养液通过梯度稀释涂布在MSM琼脂培养基上，30 ℃培养5 d。将生长出的不同形态的菌落分离出来，通过在PDA平板上连续划线分离纯化菌落。将纯化的菌株用20.00 %甘油于-80 ℃冷冻保存。

1.4.2 功夫菊酯降解菌的鉴定 ①降解菌形态学鉴定：参照《真菌鉴定手册》[14]，将真菌在PDA培养基上30 ℃培养5 d，通过肉眼观察菌落形态和显微镜观察菌丝、孢子形态等。②降解菌18SrDNA鉴定：采用试剂盒提取降解菌的总DNA进行18S rDNA扩增。采用18S rDNA的PCR反应的通用真菌引物，通用引物Primer1序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；Primer2序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC。反应体系：H2O 17.8 μl，Buffer 3 μl，dNTP 2 μl，Primer1 3 μl，Primer2 3 μl，DNA模板1 μl，酶0.2 μl，总体积3 0 μl。PCR条件：95 ℃变性，5 min；95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，1 min；循环35次，72 ℃延伸10 min。PCR产物通过1.00 %琼脂糖凝胶电泳纯化回收，送华大基因公司测序。测序结果与GenBank的核酸序列进行同源性比对，选择同源性高的序列以及对拟除虫菊酯有降解功能的菌株的相关序列，使用MEGA(version 6.0)计算进化距离，用邻近法构建系统发生树，1000次随机抽样，计算自引导值以评估系统发生树的置信度。

1.4.3 降解特性研究 从PDA平板上挑取单菌落，接种于50 mL YPD培养基中，于30 ℃摇床180 r/min培养3 d，离心收集菌体，用无机盐培养基洗涤菌体2次后，以0.5 g/L的量接入无机盐培养基中，以功夫菊酯为唯一碳源或者氮源，在30 ℃，转速180 r/min条件下培养。同时进行空白对照即无菌对照用来评估化学水解。每隔一定的时间取2 mL均匀培养液在12 000 r/min下离心2 min，将上清液过0.22 μm的水相膜，用HPLC对浓度进行检测并计算降解率。HPLC检测条件：色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18 (250×4.6 mm i.d.；5 μm)；流动相为甲醇∶水=9∶1(v∶v)，流速1.0 mL/min；紫外检测器，检测波长为218 nm，柱温30 ℃；进样量10 μl。功夫菊酯降解率η( %)按下式计算：

式中，C0为空白对照中功夫菊酯总浓度(mg/L)，Ct为t时刻样品培养液中功夫菊酯残留浓度(mg/L)。

为了研究功夫菊酯浓度对降解菌降解效果的影响，在pH=7.0，温度为30 ℃时，分别加入功夫菊酯使其浓度为20、50和100 mg/L。为了评估pH的影响，在温度为30 ℃，功夫菊酯浓度为50 mg/L时，分别调无机盐培养基的pH为5.0、7.0和9.0。同时还研究温度对降解的影响，在pH=7.0和功夫菊酯浓度为50 mg/L时，调节温度为20、30和40 ℃。

1.4.4 降解谱检测 按1.4.3方法，将降解菌按0.5 g/L接入量分别接种于包含50 mg/L溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯的无机盐培养基中，30 ℃和180 r/min条件下振荡培养7 d，pH设定为7，测定菌株对溴氰菊酯、氰戊菊酯、高效氯氰菊酯和联苯菊酯的降解率，每个处理设3次重复。

2 结果与分析

2.1 功夫菊酯降解菌的筛选与鉴定

按照上述的筛选方法从农药厂排污口淤泥中分离到1株高效降解功夫菊酯的真菌菌株PN12，将该菌株接种于50 mg/L氟氯氰菊酯的无机盐液体培养基中，于30 ℃、180 r/min培养7 d后，可降解功夫菊酯83.90 %。因此，将菌株PN12作为后续实验的研究菌株。

2.1.1 菌株形态学特性 在PDA培养基上28 ℃培养，菌落生长初期菌丝为白色，到第3天菌落变为青色。菌丝有隔，分生孢子梗为扫帚状，共有二轮分生孢子小梗，在第二轮分生孢子小梗的顶端分化出分生孢子。分生孢子为圆形或椭圆形(图1)。

2.1.2 序列分析结果 采用试剂盒提取菌株DNA，进行PCR扩增及电泳检测。PCR产物经纯化后测序，测得该序列片段长为561 bp。对该菌株的ITS序列在NCBI上进行Blast基因同源性比对分析，菌株PN12与Penicilliumsp. YY26(JF727885.1)、Penicilliumsp. PTN19(KF656713.1)和Penicilliumoxalicum114-2(KF152942.1)等青霉有99.00 %的相似度。结合该菌株的形态学特征及序列比对结果，最终将该菌株鉴定为青霉(Penicilliumsp.)。在NCBI上选择相似度高和具有降解拟除虫菊酯类农药的菌株序列，采用mega6.0步值法计算1000次做系统发育树，其系统发育树见图2。

2.2 青霉降解功夫菊酯的特性

2.2.1 降解功夫菊酯的条件优化 采用单因素分析法，分别优化了温度和pH，底物浓度等条件对青霉PN12在无机盐中对功夫菊酯的降解效果，并对数据进行差异显著性分析(P<0.05)。首先固定pH和底物浓度，考察温度对青霉PN12降解功夫菊酯的影响。检测结果(图3)表明，温度明显影响青霉PN12降解功夫菊酯，30 ℃时培养7 d对功夫菊酯的降解效果最好，降解率为83.90 %；温度20和35 ℃时降解率较低，降解率分别为53.50 %和64.30 %。这可能与该菌在30 ℃生长最佳有关。固定培养过程中的温度和功夫菊酯浓度， 由pH值对青霉PN12降解功夫菊酯的影响可知(图4)，pH值对青霉PN12降解功夫菊酯的影响比较明显，pH 在6和7时降解效果好，降解率分别为80.90 %和81.30 %，pH为4时降解率最低，为33.40 %，可见pH是影响青霉降解功夫菊酯的一个重要因素。pH值太低和太高会抑制该菌的生长。由底物浓度对功夫菊酯的降解的影响(图5)可知，菌株青霉PN12对不同浓度的功夫菊酯底物的降解效果差异不显著，对50 mg/L功夫菊酯的降解率最大。青霉PN12对不同浓度的功夫菊酯的降解符合一级反应动力学方程。在温度为30 ℃，pH为7时，青霉PN12对50 mg/L功夫菊酯的降解效果最好，7 d的降解率达到83.90 %。该温度和pH同时也是青霉PN12生长的最好条件。

图1 菌株PN12在显微镜下的孢子形态特征Fig.1 The spore morphological characteristics of PN12

图2 菌株PN12的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rRNA gene sequence of strain PN12 and related species

图3 不同温度下青霉PN12降解功夫菊酯效果Fig.3 Degradation of lambda-cyhalothrin at different temperatures

图4 不同pH下青霉PN12降解功夫菊酯效果Fig.4 Degradation of lambda-cyhalothrin at different pH values

2.2.2 降解谱检测 将青霉PN12按照上述条件培养，采用色谱法分别测定其对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯的降解效果，结果见图6。其中对溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的降解效果较好，分别为64.30 %和57.10 %，对氰戊菊酯和联苯菊酯的降解率分别为18.90 %和15.30 %。这可能是由于不同的拟除虫菊酯类农药结构差异所造成的。

3 小结与讨论

从生产拟除虫菊酯农药厂污水处理口的淤泥里筛选得到一株对功夫菊酯具有降解能力的真菌，通过形态学特征并结合ITS序列比对分析，将该菌株鉴定为青霉。该菌在pH=7.0，温度30 °C时，以0.5 g/L的菌量接种到含50 mg/L功夫菊酯的无机盐培养基中，7 d内能降解83.90 %的功夫菊酯。目前，报道的降解拟除虫菊酯类农药的降解菌大部分为细菌和酵母，而丝状真菌较少[15]。

图5 青霉PN12对不同浓度的降解功夫菊酯的降解效果Fig.5 Effect of initial lambda-cyhalothrin concentration on its degradation

同时对降解谱进行检测发现其还能降解溴氰菊酯、高效氟氯氰菊酯，但不能降解联苯菊酯和氰戊菊酯。且已有报道的该属的草酸青霉ZHJ6可降解甲胺磷、阿特拉津、氯磺隆等农药，还可以用于降解纤维素等大分子碳水化合物[15]。可见该菌应用比较广泛，具有较大的开发潜力。

国内外针对农药降解菌的筛选做了大量的工作，但仅局限于实验室条件下的纯培养和降解，然而在从实验室走向田间时受各种因素的影响和制约，应用效果并不理想。同时降解菌应用于田间后的安全性还有待进一步评价。因此，需进一步开展降解机理的研究和环境安全性评价的工作。

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(责任编辑 汪羽宁)

Screening, Identification and Characteristics of Lambda-cyhalothrin Degrading Fungus

WANG Yan-hui1, DU Liang-wei2*, LI Hong-hong3, FENG Guo-jun3,LUO Tao3

(1.Plant Protection Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007, China;2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests, Guangxi Nanning 530007, China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Guangxi Nanning 530007, China; 4.Institute of Pesticide & Environmental Toxicology, Guangxi University, Guangxi Nanning 530005, China)

A strain of cyhalothrin-degrading fungus was isolated from activated sludge from wastewater outlet of a pesticide factory. The strain was identified asPenicilliumsp. by morphological characteristics analysis and 18S rDNA sequence analysis. The degrading characteristics of this fungus for lambda-cyhalothrin were investigated with HPLC. The optimal conditions for the fungus to degrade lambda-cyhalothrin were as follows: pH 7.0, 30 ℃ and 50 mg/L. Under this condition, the strain could degrade 83.90 % of lambda-cyhalothrinin medium after 7 d. The strain also degraded deltamethrin and beta-cypermethrin.

Lambda-cyhalothrin;Biodegradation;Penicilliumsp.;Degradation characteristics

1001-4829(2016)08-1879-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.022

2016-04-19

广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2014YD11)；广西作物病虫害生物学重点实验室基金项目(14-045-50-ST-08)

王彦辉(1984-)，男，河南开封人，博士，副研究员，主要从事农药污染与生物修复工作，*为通讯作者，E-mail：dulily@gxu.edu.cn。

S482;Q938

A