海藻酮糖测定方法的探讨

黄忠华，梁 智

（广西轻工业科学技术研究院，广西 南宁 530031）

海藻酮糖测定方法的探讨

黄忠华，梁 智

（广西轻工业科学技术研究院，广西 南宁 530031）

文章采用高压液相色谱法（HPLC）测定海藻酮糖的含量，通过分析比对两个厂家的液相色谱系统和四种不同厂家和类型的液相色谱柱测定结果的差异，最终确定用Waters公司氨基型碳水化合物分析专用柱来测定溶液中海藻酮糖的含量，流动相为乙腈：水=（4∶1），示差折光检测器。

海藻酮糖；液相色谱

蔗糖、异麦芽酮糖和海藻酮糖是同分异构体，根据查到的国内外所有文献［1-10］的报道，蔗糖在蔗糖异构酶的催化作用下，会专一的生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，不同微生物来源的酶，生成异麦芽酮糖和海藻酮糖的比例不一样，这也符合酶的专一性的特征，此外还有因蔗糖水解产生的果糖、葡萄糖等其他微量组分。海藻酮糖和异麦芽酮糖作为蔗糖的同分异构体，结构上的细微差异使得两者性质和用途既相似又有所区别，如甜度，前者为蔗糖的52%，后者为蔗糖的70%；溶解度，25℃时，异麦芽酮糖的溶解度为25%左右，而海藻酮糖的溶解度远远大于此，因此至今未有晶体产品问世。正因为海藻酮糖除了具备异麦芽酮糖非致龋齿性、不引起血糖升高等一样的性质外，还具有溶解度高，吸湿性好等优势，更利于在高糖度的食品、保健品和化妆品中发挥作用。目前，蔗糖、异麦芽酮糖都有标准品和检测方法，但是海藻酮糖没有标准品，本课题组通过电话咨询如Sigma公司等标准品供应商，也委托专业的试剂药品经销商采购，经多方努力依然无法得到海藻酮糖标准品或者含量很高的对照品，因此，本文就是针对海藻酮糖的测定方法进行研究与探索。

1 实验

1.1 材料

异麦芽酮糖母液：广西科学院生物所。

异麦芽酮糖：广西维科特生物技术有限公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、异麦芽酮糖、乙腈（分析纯）：市售。

1.2 主要仪器设备

液相色谱系统：美国安捷伦1100，GPC色谱分析工作站，配示差检测器，大连依利特S1201自动进样器；美国Waters液相色谱系统，威玛龙色谱分析工作站，配示差检测器，515泵，大连依利特S3101自动进样器；色谱柱：Waters公司氨基型碳水化合物分析专用柱、大连依利特氨基柱、伯乐Ca2+型糖分析柱、广州菲罗门Ca2+型糖分析柱。

1.3 异麦芽酮糖母液的预处理

异麦芽酮糖母液一般锤度为50°Bx左右，先用高纯水稀释至30°Bx左右，添加2.0%～3.0%活性炭，在60～70℃条件下保温搅拌30～60分钟，过滤，取滤液过阴阳离子混合交换树脂，使电导率将至10ms/cm以下，备用。

1.4 样品溶液的配置

样品溶液的配置：液相色谱测定前，将预处理后的异麦芽酮糖母液、蔗糖、葡萄糖、果糖、异麦芽酮糖用高纯水稀释至1°Bx（即1.0%）左右，经0.22um水系微孔滤膜过滤。

1.5 色谱条件及分析方法

方法一：色谱柱：伯乐Ca2+型糖分析柱、广州菲罗门Ca2+型糖分析柱，流动相：高纯水，柱温80～85℃，进样浓度1.0%，进样量20ul，流速：1.0ml/min。

方法二：Waters公司氨基型碳水化合物分析专用柱、大连依利特氨基柱，流动相：乙腈：水=4:1，柱温30℃，进样浓度1.0%，进样量20ul，流速：1.0ml/min。

具体见表1。

表1 两种不同液相色谱检测方法操作参数比较

1.6 结果分析与讨论

本项目开展之前，我院承担了“果葡糖浆分离”、“甘露醇和山梨醇的分离”、“木糖和L-阿拉伯糖的分离”等多个科研项目的研究，均采用方法一（色谱柱：Ca2+型糖分析柱；洗脱剂：高纯水；柱温：80～85℃；流速：0.6mL/min；示差检测器：40℃；进样浓度：约1%；进样量：20ul）对物料进行液相色谱分析检测，均获得成功，分离效果非常好，在此基础上，本项目的前期研究阶段（模拟移动床连续分离之前的实验）一直沿用方法一，采用面积归一化法，对异麦芽酮糖母液进行分析测试，液相分析图谱如下。

图1 果糖和葡萄糖液相图谱

图2 木糖和L-阿拉伯糖液相图谱

图3 甘露醇和山梨醇液相图谱

图4 异麦芽酮糖母液液相色谱图

由以上液相色谱分析图可见，异麦芽酮糖和海藻酮糖在Ca2+型糖分析柱上的出峰时间很接近，前者为9.915分钟，后者为11.173分钟，两者只相差1.258分钟，而且蔗糖、葡萄糖的出峰时间也为9分钟附近，有时候出现了多峰重叠的现象，说明两者在Ca2+型糖分析柱上虽然可以分离，但是难以达到像果糖—葡萄糖（图1），木糖—L-阿拉伯糖（图2），甘露醇—山梨醇（图3）那样完美分离，由此可以预见，本项目的分离难度系数很大。

中试实验开展之后，一些科研人员认为采用方法一对海藻酮糖进行检测，出现有些峰重叠的现象，会影响测试结果，根据文献［4］，环民霞，林璐等在《淀粉与淀粉糖》2007年第4期发表的文章《利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制备新型甜味剂异麦芽酮糖》所述，采用氨基型分析柱，乙腈：水=80：20为洗脱剂，流速0.8Ml/min，示差检测器40℃，进样量20ul，检测结果如下。

图5 文献报道海藻酮糖液相色谱测试图

同时参照异麦芽酮糖企业标准（QB 1581-1992）和相关文献资料［1-10］，在中试试验阶段采用方法二对产品进行分析，两种分析方法及液相色谱分析结果如下。

图6 采用方法一用广州菲罗门Ca2+型糖柱对异麦芽酮糖母液测试液相色谱图

图7 采用方法一用伯乐Ca2+型糖柱对异麦芽酮糖母液测试液相色谱图

图8 采用方法二用大连依利特氨基型氨基柱对异麦芽酮糖母液测试液相色谱图

图9 采用方法二用Waters氨基型碳水化合物分析柱对异麦芽酮糖母液测试液相色谱图

表2 方法一液相结果

表3 方法二液相结果

由以上图表可见，异麦芽酮糖和海藻酮糖在方法一（即Ca2+型糖分析柱）上的出峰时间很接近，而方法二（即氨基型氨基柱）上，甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他组分在20分钟前就已经出峰，而异麦芽酮糖的出峰时间为23.45分钟，海藻酮糖的出峰时间为26.15分钟，两者相差2.7分钟，可见，方法二更适合用于检测海藻酮糖的含量。同时发现美国伯乐和广州菲罗门的Ca2+型糖分析柱的检测结果没有显著差异，但是Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱比大连依利特的NH2+型氨基柱的峰形、分离效果和重现性要好得多，因此采用方法二，Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱，通过面积归一化法对本项目中试分离实验及结果进行海藻酮糖的定性和定量分析检测。

分别按乙腈含量80%、75%配置流动相，以Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱为色谱柱，按照方法二的检测方法对异麦芽酮糖母液进行检测，结果如下。

图10 采用方法二按80%乙腈测试异麦芽酮糖母液液相色谱图

图11 采用方法二按75%乙腈测试异麦芽酮糖母液液相色谱图

由以上图可见，采用乙腈含量80%的分离效果比75%的要好一点，因此，本项目的后期实验均采用乙腈含量80%（即乙腈：水=4:1），Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱为色谱柱，按照方法二的检测方法对异麦芽酮糖溶液进行检测。

［1］ QB 1581-1992食品添加剂-异麦芽酮糖，中华人民共和国轻工行业标准［J］，1993年4月.

［2］ 林璐，李莎等.生物催化生产异麦芽酮糖的研究进展，食品与发酵工业［J］，2007年第6期，91-94.

［3］ 薛蓓，梁甲元.海藻酮糖的研究进展，食品与发酵工业［J］，2012第11期，127-130.

［4］ 环民霞，林璐等.利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制备新型甜味剂异麦芽酮糖，淀粉与淀粉糖［J］，2007年第4期，22-24.

［5］ 唐文竹，陈放等.蔗糖异构酶催化生产异麦芽酮糖研究进展，微生物学通报［J］，2012年第9期1314-1322.

［6］ 李莎，徐虹.微生物来源蔗糖异构酶的研究进展及应用，化工进展［J］，2011年第6期，1326-1331.

［7］ 甘宾宾，蒋世琼.高效液相色谱法测定帕拉金糖，广西化工［J］，2001年第3期，40-41.

［8］ 沃尔夫冈·瓦赫等.含海藻酮糖的组合物，其制备及其用途，PCT中国专利申请号：201080023895.0.

［9］ 韦宇拓，梁甲元等.一种纯化海藻酮糖的方法，中国专利申请号：201310428359.1.

［10］李丕武，王瑞明等.从异麦芽酮糖母液分离异麦芽糖和海藻酮糖的方法，中国申请号：201410284332.7.

TS249．9

B

2095-820X（2016）01-07

2016-01-06

2013年广西科学研究与技术开发计划项目，制糖业共性关键技术研发与示范重大专项，合同编号：桂科重：1348002-6，计划类别：重大专项。

黄忠华（1982-），男，广西田阳人，大学本科，工程师，从事糖类及其深加工与应用的研究，Email：18777162820@126.com。