15d-PGJ2对神经元氧糖剥夺/复氧损伤的影响

李 键， 冯 江， 段 宇， 徐 锋， 毛仁玲



15d-PGJ2对神经元氧糖剥夺/复氧损伤的影响

李 键1， 冯 江1， 段 宇1， 徐 锋2， 毛仁玲1

目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)激动剂15d-PGJ2对神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 采用原代培养的小鼠胎鼠大脑皮质神经元，建立OGD/R损伤模型。将培养的神经元细胞进行分组，Western blot检测各组神经元内LC3-1、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Beclin1、AMPK、mTOR及p70S6K等蛋白的表达；MTT法检测细胞活性，乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定细胞毒性。结果 OGD/R损伤6 h、12 h及24 h后神经元LC3-Ⅱ、Beclin 1表达明显增高，而p62表达持续下降，神经元的生存率明显下降，LDH漏出率增加。15d-PGJ2可显著降低LC3-Ⅱ和Beclin 1表达水平，改善神经元的生存率及降低LDH的漏出率。OGD/R后Bcl-2的蛋白表达水平均明显减少，而Beclin 1表达则显着增加。15d-PGJ2预处理显著增加OGD/R 24 h的Bcl-2表达量。利用Bcl-2 siRNA或scRNA转染神经元细胞发现，Bcl-2 siRNA可消除15d-PGJ2对OGD/R后各时间点的抑制效应。结论 15d-PGJ2能够有效地对神经元OGD/R损伤起到保护作用，其机制可能是通过上调Bcl-2的表达进而抑制自噬的发生实现的。

缺血再灌注； 自噬； 过氧化物酶体增殖物激活受体γ； Bcl-2； Beclin1

缺血性脑卒中已成为严重威胁人类健康的临床常见病，在中国，缺血性脑卒中约占脑卒中的80%[1]。目前治疗手段仍以早期溶栓为主，但溶栓时间窗短及缺血再灌注损伤等因素影响溶栓疗效及预后。如何在脑组织缺血缺氧的耐受时间窗内，给予有效的神经细胞保护，已成为减轻脑缺血再灌注损伤的一个热门话题。

自噬是细胞的一种自我降解途径，可通过膜囊泡包裹的方式将蛋白质、RNA、老化受损细胞器等转运至溶酶体降解，从而维持内环境稳态[2]。目前已有研究表明，脑缺血后，能量感应、内质网缺氧及氧化应激等均可刺激神经元自噬[3]，且在缺血再灌注过程中，细胞的自噬与Beclin 1的表达上调有关[4]。Beclin 1基因的表达可被Bcl-2家族的多域蛋白所抑制，过氧化物酶增殖物激活受体反应元件(perosisome proliferater-activated receptor response element，PPRE)激动剂可通过上调Bcl-2的表达，从而防止神经元的缺血再灌注损伤[5]。因此，本研究旨在观察过氧化物酶增殖物激活受体-γ(perosisome proliferater-activated receptor， PPAR-γ)激动剂15-Deoxy-Delta-12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2)对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 制备氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的细胞模型及分组

1.1.1 制备氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的细胞模型 妊娠15 d的C57BL/6J雌性小鼠(由南京医科大学动物实验中心提供)，予10%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉后，切开孕鼠下腹取出子宫，剥离胎鼠并分离出胎鼠的大脑皮质组织，将皮质组织剪碎并加入胰蛋白酶，37 ℃条件下消化15 min后加入5 ml DMEM溶液终止消化，离心后弃去上清液，将细胞悬液置于培养板并放置在37 ℃ 5% CO2的培养箱内进行培养。原代神经元培养到第7天时，弃去培养基，并加入无糖的DMEM培养基，每孔加入1 ml，然后将培养板置于CO2培养箱(37 ℃，95%N2，5%CO2)进行缺氧缺糖培养120 min。OGD培养结束后，弃去无糖DMEM培养基，预温37 ℃PBS洗涤培养板一次，加入神经元专用培养基，每孔加入1 ml，置于5%CO2培养箱继续培养。对照组不作任何缺氧缺糖处理，复氧后24 h终止实验。

1.2 实验分组和设计

1.2.1 15d-PGJ2对神经元OGD/R后细胞存活率及自噬的影响 将原代神经元培养至7 d开始OGD处理，根据再复氧复糖的时间点不同，随机分为5组：对照组、OGD/R 2 h组、OGD/R 6h组、OGD/R 12 h组、OGD/R 24 h组；再根据OGD/R前加入15d-PGJ2剂量的不同，将OGD/R 24 h随机分为4组：对照组+15d-PGJ2(0 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(0.1 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(0.5 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(1.0 μmol)，对上述各组进行MTT及LDH漏出率检测，采用Western blot法分析各组LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62的表达。

1.2.2 15d-PGJ2对神经元细胞AMPK、mTOR、p70S6K表达的影响 将原代神经元发生OGD后，根据复糖复氧时间分为对照组、OGD/R 2 h组、OGD/R 6 h组、OGD/R 12 h组及OGD/R 24 h组；再根据OGD/R前有无15d-PGJ2，随机分为4组：对照组、OGD/R 24 h组、对照组+15d-PGJ2(1.0 μmol)组、OGD/R 24 h+15d-PGJ2(1.0 μmol)组，对照组不进行OGD/R处理。Western blot法分析各组p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K的表达。

1.2.3 15d-PGJ2对神经元细胞Bcl-2/Beclin 1表达的影响 将原代神经元发生OGD后，根据复糖复氧时间分为对照组、OGD/R 2 h组、OGD/R 6 h组、OGD/R 12 h组及OGD/R 24 h组；并将原代神经元发生OGD后24 h随机分为对照组、OGD/R 24 h组、对照组+15d-PGJ2(1.0 μmol)组、OGD/R 24 h+15 d-PGJ2(1.0 μmol)组；再将原代神经元OGD/R 24 h时，根据是否有Bcl-2 siRNA干扰，及OGD/R前是否加入15d-PGJ2(1.0 μmol)干预，随机分为6组：对照组+Bcl-2 scRNA组、OGD/R+Bcl-2 scRNA组、OGD/R+15d-PGJ2+Bcl-2 scRNA组、对照组+Bcl-2 siRNA组、OGD/R+Bcl-2 siRNA组、OGD/R+15d-PGJ2+Bcl-2 siRNA组。Western blot分析各组Bcl-2、LC3-II、Beclin-1、p62的蛋白表达情况。对照组不进行OGD/R处理，Western blot法分析以上各组Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的蛋白表达情况。

1.3 细胞活力测定 神经元的活力测定则采用MTT比色法来确定。每孔加入20 μl MTT溶液，在细胞培养箱37 ℃下孵育4 h，吸出孔内培养液后再加入二甲基亚砜溶液，待颗粒完全溶解后以多孔分光光度计在570 nm测定吸光度，记录结果并绘制曲线图。以对照组细胞活力为100%，细胞死亡的百分比计算用下面的公式：细胞死亡(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 细胞毒性测定 细胞毒性通过乳酸脱氢酶(LDH)测定法评估。OGD/R后各组细胞培养物的上清液保留，PBS漂洗后，用1%的Triton X-100在37 ℃下30 min指示，制备上清液和细胞裂解液的样品，进行LDH漏出率的测定。多孔分光光度计测定440 nm处光密度值(A)，计算LDH漏出率(%)=(A+/A+空白)/(A-/A-空白)×100%。

1.5 Bcl-2 RNA干扰 使用Lipofectamine 2000转染试剂盒，待神经元细胞生长密度达到50%时实施转染。转染前用Opti-MEM I Medium的稀释液将其稀释为比例为1∶50，轻柔混合后在室温下孵育5 min，并将转染的质粒按照1∶25的比例进行稀释。将两者稀释的液体轻柔混合并放置在室温20 min，待其形成Bcl-2-siRNA-转染混合物。将Bcl-2-siRNA-转染混合物(500 μl)加入六孔板中，轻柔晃动，放置在孵箱中进行培养，对照组则以Bcl-2-scRNA替代Bcl-2-siRNA进行试验。

1.6 Western blot检测 将实验组细胞弃去培养液，用预冷的PBS清洗2～3遍，加入适量的细胞蛋白裂解液，冰上不停摇晃20 min以充分裂解细胞，用细胞刮顺序刮取细胞，移液器收集细胞至1.5 ml离心管中，4 ℃条件下12000 r/min离心10 min，收集上清即为各组蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。所用一抗为LC3(1∶1000)、Beclin1 (1∶500)、Bcl-2 (1∶500)、mTOR (1∶200)、p-mTOR (1∶200)、p70S6K(1∶200)及β-actin(1∶5000)。

2 结 果

2.1 15d-PGJ2对神经元OGD/R后细胞存活率的影响 随着再灌注时间的延长，与对照组相比，各组神经元细胞的生存率明显下降(P<0.05)(见图1A)。同时，与对照组相比，LDH的漏出率在再灌注2～24 h后逐步增加，差异有统计学意义(P<0.05) (见图1B)。在再灌注开始前，分别予不同浓度的15 d-PGJ2(0.1，0.5，1 μmol)加入到培养基中，我们发现，与OGD/R组相比，0.5～1.0 μmol的15 d-PGJ2能显著增加神经元细胞的存活率、抑制OGD/ R诱导的LDH释放，且差异均有统计学意义(P<0.05)(见图1C、1D)。

2.2 15d-PGJ2对神经元OGD/R后细胞自噬的影响 与对照组相比，LC3-Ⅱ/LC3-I的比值和Beclin 1的表达在再灌注后的6 h开始显著增加(P<0.05)，而p62的表达在再灌注后的6 h明显降低，并持续至24 h(P<0.05) (见图2A、B)。在再灌注开始前，分别予不同浓度的15d-PGJ2(0.1～1 μmol)加入到培养基中，结果发现，与OGD/R组相比，15 d-PGJ2的浓度在0.5～1.0 μmol时， LC3-Ⅱ/LC3-I的比值和Beclin 1的表达均显著降低，而p62的表达则显著增加(P<0.05)(见图2C、D)。

2.3 15d-PGJ2对神经元细胞AMPK、mTOR、p70S6K表达的影响 与对照组相比，OGD/R后2 h、6 h及12 h，15d-PGJ2可诱导磷酸化的AMPK明显增加(P<0.05)，随着OGD后再灌注时间的延长，其表达逐渐下降，至再灌注24 h回到正常水平(P>0.05)(图3A、B)。此外，与对照组相比，OGD/R后磷酸化的mTOR和p70S6K表达量在2 h及6 h均明显下降(P<0.05)，在再灌注后24 h均恢复到正常水平(P>0.05)(见图3A、B)。在OGD/R后24 h时，予以15d-PGJ2干预，与对照组相比，磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K水平均无显著差异(P>0.05)(见图3C、D)。

2.4 15d-PGJ2对神经元细胞Bcl-2/Beclin 1表达的影响 与对照组相比，OGD/R后6 h、12 h及24 h时，Bcl-2的蛋白表达水平均明显减少，而Beclin 1表达则显着增加(P<0.05)(见图4A、B)。在OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)可显著上调Bcl-2的蛋白表达，降低Beclin 1表达量，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图4C、D)。在OGD/R后24 h，在15d-PGJ2作用下，与给予Bcl-2 scRNA的对照组相比，转染Bcl-2 siRNA的神经元细胞内Bcl-2的蛋白表达水平明显下调，Beclin 1蛋白表达水平则明显增高，且LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显升高(P<0.05)(见图4E、F)。

A：MTT测定法分析细胞活力；B：通过LDH漏出率分析细胞毒性；C、D：15d-PGJ2对神经元细胞存活率的影响。在再灌注开始前，在神经元培养基中给予不同浓度的15d-PGJ2(0.1、0.5、1 μmol)，OGD/R后24 h，分析细胞活力和LDH漏出率。与对照组比较*P<0.05;与OGD/R组比#P<0.05

图1 15d-PGJ2对原代神经元细胞OGD/R后存活率的影响

A、B:当原代神经元发生OGD/R损伤后，LC3-Ⅱ/LC3-I的比值、Beclin-1及p62表达的影响； C、D：15d-PGJ2对OGD/R后LC3-Ⅱ/LC3-I的比值、Beclin-1及p62表达的影响。与对照组比较*P<0.05；与OGD/R组比较#P<0.05

图2 15d-PGJ2对神经元OGD/R后细胞自噬的影响

A、B：神经元细胞OGD/R后磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K表达量的变化；C、D：在OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)对磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K水平的影响。与对照组比较*P<0.05;与OGD/R组比较#P<0.05

图3 15d-PGJ2对神经元细胞AMPK、mTOR、p70S6K表达的影响

A、B:在OGD/R后，Bcl-2及Beclin 1的蛋白表达量的变化；C、D：OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)对Bcl-2及Beclin 1的蛋白表达的影响；E、F：在OGD/R后24 h，Bcl-2 siRNA对Beclin 1、Bcl-2及LC3-Ⅱ/LC3-I的表达量的影响。与对照组比较*P<0.05；与OGD/R组比较#P<0.05

图4 15d-PGJ2对神经元细胞Bcl-2/Beclin 1表达的影响

3 讨 论

目前普遍认为，在脑缺血再灌注过程中，细胞的自噬起关键作用。且研究发现，PPAR反应元件激动剂可通过调节Bcl-2，从而对神经元的缺血再灌注损伤起一定程度的保护作用[5]。但在缺血再灌注过程中，PPAR反应元件激动剂是否对自噬产生影响，国内外尚未见相关报道。

脑缺血的本质为缺氧缺糖，氧糖剥夺(OGD)模型可模拟脑缺血病理变化。参照文献[6]，本实验成功复制神经元OGD/R损伤的细胞模型，选用PPAR反应元件激动剂15d-PGJ2，观察其对OGD/R损伤的影响。结果发现，OGD/R损伤后，神经元细胞的生存率明显下降，LDH的漏出率则显著升高。给予15d-PGJ2干预后，神经元细胞的生存率则明显升高，LDH的漏出率下降，提示15d-PGJ2可对原代神经元发生OGD/R损伤后起到显著保护作用。

自噬在哺乳动物正常脑组织内通常很难检测到，但在脑缺血的情况下，其表达则显著增强。Gabryel等[7]发现在脑缺血的不同阶段，自噬可能扮演着双重角色。当脑轻度缺氧或是局部缺血时，自噬的激活能起到保护效应[8]。然而，在严重缺氧缺血的情况下，过度激活的自噬过程则是有害的[9]。Mo等[10]在利用PC12细胞复制缺血性卒中细胞模型中发现，β-细辛脑可通过下调自噬所依赖的Beclin 1表达，对OGD/R后细胞产生保护效应。相反地，Shi等[11]在脑缺血的细胞模型中发现，自噬的过度表达则促进神经元的死亡。

LC3-Ⅱ是真核细胞自噬研究中应用最广泛的特异性蛋白，Beclin1 1是Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合物中的组成成分，该复合物可诱导自噬的发生。我们在本次研究中发现，在OGD/R发生后6～24 h，LC3-Ⅱ和Beclin 1的表达显著增加，这与文献报道[12，13]。加入15d-PGJ2后我们发现，LC3-Ⅱ和Beclin 1的表达水平则明显下降。此外，自噬抑制剂3-MA可明显降低LC3ⅡI的蛋白表达量、增加细胞的存活率及减少LDH的漏出率。这些研究结果提示，神经元细胞在OGD/R后自噬表达水平显著增强，从而促进OGD/R损伤后神经元的死亡。15d-PGJ2则可通过抑制自噬的表达，对神经元OGD/R损伤后起到一定程度的保护作用。

目前已有研究发现，在脑缺血所致的神经元细胞死亡中，自噬明显增强，但调节自噬激活的具体信号通路仍不明确。Wang等[14]研究证实，在脑缺血发生过程中，TSC2-mTOR-S6K1信号通路在自噬的表达过程中起重要作用。Matsui等[15]研究发现，心肌缺血时可通过AMPK-mTOR通路激活自噬的发生，而在再灌注时，自噬的激活却依赖于Beclin 1通路，而非AMPK途径。本实验将原代神经元进行2 h的OGD后再灌注2～24 h，发现在OGD的初始阶段，p-AMPK的蛋白表达水平明显增加，同时p-mTOR及p-p70S6K的表达量下降，但这3种蛋白的磷酸化水平均在再灌注24 h后恢复到正常水平，且在OGD/R后24 h时，15 d-PGJ2对p-AMPK、p-mTOR及p-p70S6K表达变化无显著影响。同时，我们还发现，OGD/R后6 h、12 h及24 h时，Bcl-2的蛋白表达水平均明显下降，而Beclin 1的蛋白表达量则显着增加，15d-PGJ2(1 μmol)可显著上调Bcl-2、降低Beclin 1的蛋白表达量。同时，本实验通过细胞转染技术进一步研究发现，Bcl-2 siRNA可阻止15d-PGJ2对Beclin 1、Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-1的影响。以上研究结果提示我们，15d-PGJ2对神经元OGD/R损伤的保护作用可能是通过Bcl-2/Beclin 1信号通路实现的，而并非依赖于AMPK-mTOR- p70S6K途径，但是否还存在其他信号通路参与自噬过程的调节，还需要进一步研究。

综上所述， 15d-PGJ2能够有效的对神经元OGD/R损伤起到保护作用，其机制可能是通过上调Bcl-2的表达进而抑制自噬的发生实现的，从而为临床上缺血性脑卒中的治疗提供了新的思路。

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Effect of 15d-PGJ2on the neuron oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury

LI Jian,FENG Jiang,DUAN Yu,et al.

(Department of Neurosurgery,Huadong Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To investigate the effect of PPAR-γ agonist 15d-PGJ2on the neuron oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury and to clarify the underlying mechanism.Methods In this study,We established the cerebral ischemia-reperfusion models in vitro.Primary cortical neuron was exposed to a paradigm of ischemic insult by using an oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) device and were randomly divided into groups according to the experimental scheme.The expression of LC3、Bcl-2、Beclin1、AMPK、mTOR and p70S6K protein were deterined by Western blot.The neuronal cell viability was detected by MTT and the cytotoxicity was determined by lactate dehydrogenase (LDH) leakage.Results The expression of LC3-Ⅱ and Beclin 1 protein significantly increased,while the p62 protein expression decreased obviously.The neuronal cell viability was decreased and the LDH leakage was increased evidently.The LC3-Ⅱ and Beclin 1 protein expression were decreased significantly by the treatment of 15d-PGJ2,the neuronal cell viability was improved and the LDH leakage was decreased.The Bcl-2 protein expression decreased while the Beclin 1 protein expression increased obviously in the OGD/R injury model.And the pretreatment of 15d-PGJ2could upregulate Bcl-2 protein expression.Bcl-2 siRNA could abrogate the effect of 15d-PGJ2on OGD/R injury model.Conclusions Our study demonstrated that 15d-PGJ2could effectively protect the neuronal OGD/R injury,the underlying mechanism may involve in the upregulation of Bcl-2 protein expression and inhibit the process of autophagy.

Ischemia-reperfusion; Autophagy; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Bcl-2; Beclin-1

1003-2754(2016)10-0873-05

2016-06-25；

2016-09-29

(1.复旦大学附属华东医院，上海 200040；2.复旦大学附属华山医院，上海 200040)

毛仁玲,E-mail:18939953717@189.cn

R741.02

A