MiR-615-5p缓解Aβ25-35诱导的APOE4+/-型海马细胞的凋亡和变性

姚 婕， 马巧亚， 阎丽萍， 张红梅， 姬文涛



MiR-615-5p缓解Aβ25-35诱导的APOE4+/-型海马细胞的凋亡和变性

姚 婕， 马巧亚， 阎丽萍， 张红梅， 姬文涛

目的 探讨miR-615-5p对人海马细胞的凋亡和变性的影响及潜在机制。方法 运用实时定量PCR检测正常、家族性AD和散发性AD老年人血液中miR-615-5p的表达水平，以及APOE4+/-型人胚海马细胞和Aβ诱导的APOE4+/-海马细胞中miR-615-5p的表达水平；在Aβ预处理的APOE4+/-型海马细胞中分别转染miR-615-5p mimic和inhibitor后检测细胞凋亡、氧化应激标志物含量和突触生长标志蛋白的表达水平；运用生物学信息分析和荧光素酶报告基因技术预测并验证mir-615-5p对APOE基因的靶定调控关系。结果 散发性AD患者和细胞模型中miR-615-5p的表达水平显著下调；过表达miR-615-5p显著抑制海马细胞的凋亡和细胞内氧化应激，并促进细胞内突触生长蛋白的表达，而沉默miR-615-5p则作用相反；mir-615-5p可靶定结合APOE mRNA，并下调APOE4+/-海马细胞中APOE4蛋白的表达。结论 mir-615-5p通过靶向调节APOE，缓解Aβ25-35诱导的APOE4+/-型海马细胞的凋亡和变性。

mir-615-5p； 阿尔茨海默病； 载脂蛋白4； 细胞凋亡； 氧化应激

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种严重危害老年人身心健康的神经系统退行性疾病，从最初的记忆减退，到失语、失聪、失用、失明，乃至最终的人格和行为完全改变[1]。我国人口日趋老龄化，AD造成的家庭负担和社会负担也随之凸显。近年来，大量临床和基础研究表明β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在脑内的进行性沉积是AD的一项重要病理特征[2～5]。Aβ由淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)基因的编码产物经β-或γ-分泌酶水解而成，经运输进入脑脊液或脑间质液中[2,3]。载脂蛋白E(apolipoprotein E)是机体内运输脂蛋白和多种多肽的重要功能蛋白[6,7]。APOE的等位基因ε4编码的蛋白APOE4与Aβ有高度的亲和性，在Aβ运输进入脑脊液的过程中发挥重要作用[6,8,9]。现有研究表明，APOE4表达个体比非APOE4表达个体的AD患病风险至少高4倍，APOE4已成为散发性AD的重要标志物和治疗靶点[4,10,11]。

MiR-615-5p是近年来新发现抑癌miRNA，对多种组织器官的癌变细胞的生长和转移具有抑制作用[12,13]。

最近，有报道显示miR-615在运动神经元中的表达水平显著高于脊髓源性神经干细胞[14]，提示其在神经细胞分化和功能形成过程中发挥潜在作用。本研究对比正常、家族性AD和散发性AD老年人血液中miR-615-5p的表达水平，发现miR-615-5p散发性AD老年患者血液中表达水平显著降低；进一步在APOE4+/-型人胚海马细胞中探索miR-615-5p对Aβ25-35诱导的海马神经元的凋亡和功能的影响，以期为散发性AD的治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 磷酸缓冲盐溶液PBS、青-链霉素购自天津宝鑫生物；Hoechst33258细胞凋亡染色剂、Aβ25-35、Aβ1-42、荧光素酶报告基因检测试剂盒、胆碱乙酰转移酶活性CAT检测试剂盒、丙二醛MDA含量测定试剂盒、活性氧ROS含量测定试剂盒、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国Sigma公司；脂质体3000转染试剂、DMEM/F12培养基、N2、B27、胎牛血清 (FBS)、胶原酶I、胰蛋白酶等购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自北京天根生化科技公司；实时定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；PVDF膜、ECL蛋白发光检测试剂盒购自美国Millipore公司；兔抗小鼠caspase-3抗体、兔抗小鼠caspase-9抗体、兔抗小鼠GAP-43抗体、兔抗小鼠Syn抗体、兔抗小鼠APOE4抗体、兔抗小鼠Aβ抗体和兔抗小鼠β-tululin抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG购自英国Abcam公司；细胞培养板、培养瓶和其他细胞培养耗材购自南京赛业公司；miR-615-5p反转录试剂盒(含特异性反转录引物)和miR-615-5p实时定量试剂盒(含miR-615-5p上下游检测引物和内参基因U6 RNA引物)由广州锐博生物技术有限公司提供；2’-甲氧基修饰的单链miR-615-5p 模拟寡核苷酸(mimic)、抑制寡核苷酸(inhibitor)和阴性对照寡核苷酸NC由瑞士Roche公司设计、合成并进行有效性检测(最适浓度为60 nmol)；其他试剂均为进口或国产分析纯。Bio-Rad实时定量PCR仪、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 伦理学声明 本研究的方案经由西安交通大学伦理学委员会审核并批准。受试患者和志愿者均被告知详细情况，并由本人/监护人签订书面协议。

1.2.2 血液样本采集 本研究受试者包括18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散发性AD患者。各组受试者年龄在55～70岁之间，平均年龄63岁左右，受试者中无脑部或全身感染、各类肿瘤、脑部外伤、卒中、癫痫等疾患，无过度瘦弱和过度肥胖者。受试者血液样本由技术熟练的老年科住院部护士采集，采血在气温适宜的早晨(进食前)进行，于每个受试者前臂静脉采集5 ml左右血液样本，4 ℃保存备用。

1.2.3 APOE4+/-型人胚海马细胞的分离培养 APOE4+/-型海马细胞来源于2012年-2015年间本院的3例稀有病例,12～14 w流产、基因型为APOE4+/-的胚胎。分离双侧海马， 无血清DMEM/F12培养液清洗后，剔除血管和脑膜后剪成1 mm3左右的小块，0.125%胰酶、37 ℃消化10～12 min，加入少量含血清培养液终止消化。800 r/min离心 5 min，弃上清；加入适量培养基，800 r/min离心 5 min，弃上清，加入适量DMEM/F12培养液(添加1% N2、2% B27、20 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF)重悬沉淀，接种于细胞培养板上，置 CO2于37 ℃、95%湿度、5%CO2条件的培养箱中培养。1 h后吸取未贴壁神经元，计数后接种105个细胞于6孔培养板中。培养 24 h后更换新培养液，之后每2～3次半量换液，观察神经元形态和生长情况。培养至10 d左右的细胞用于后续研究。

1.2.4 血液和海马细胞中miR-615-5p表达水平的检测 用血液总RNA提取试剂盒和细胞总RNA提取试剂盒分别提取血液样本和海马细胞中的总RNA，运用miR-615-5p反转录试剂盒合成cDNA，定量试剂盒检测miR-615-5p表达水平。反应体系为25 μl体系，包括2 μl的cDNA模板(含500 ng cDNA)、上下游定量引物各0.5 μl(终浓度为0.5 μmol/L)、12.5 μl反应缓冲液和9.5 μl超纯水。反应条件如下：95 ℃预变性1 min,以95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸60 s的条件扩增35个循环，Bio-Rad实时定量PCR仪自带IQ5软件分析计算扩增循环数Ct值，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.2.5 Hoechst 33258染色检测海马细胞凋亡 对照和各处理以4%甲醛溶液固定1 h，以预冷的PBS溶液洗涤两次，添加5 μg/ml Hoechst 33258染液覆盖细胞样品，室温染色4 min。PBS洗涤3次，每次3 min，在荧光显微镜下观察(340 nm激发光)。结果判定标准：活细胞呈弥散、均匀荧光，凋亡内可见浓染、致密的荧光颗粒，有3个或以上的DNA荧光碎片的细胞为凋亡细胞，Epies (R) Porfile Analyzer细胞自动计数软件对正常细胞和凋亡细胞进行计数，然后计算凋亡细胞比例。

1.2.6 Western印迹法检测蛋白表达水平 收集各组细胞，总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白含量；配制SDS-PAGE凝胶，每个胶孔上样50 ng蛋白样品进行电泳；2.5 h后湿转法转膜；室温下用5%脱脂奶粉缓冲液封闭转有蛋白的PVDF膜1 h，分别加入兔抗小鼠caspase-3抗体(1∶400)、兔抗小鼠caspase-9抗体(1∶400)、兔抗小鼠GAP-43抗体(1∶300)、兔抗小鼠Syn抗体(1∶300)、兔抗小鼠APOE4抗体(1∶200)、兔抗小鼠Aβ抗体(1∶200)和兔抗小鼠β-tululin抗体(1∶800)，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10 min；加HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室温孵育2 h；TBST清洗4次，每次8 min，孵育ECL发光液，于凝胶成像系统中曝光显影、采集图像， Quantity One软件进行条带分析，重复3次以上。

1.2.7 CAT活性、ROS和MDA水平的检测 收集各组细胞，离心弃上清，分别运用胆碱乙酰转移酶活性CAT检测试剂盒、丙二醛MDA含量测定试剂盒、活性氧ROS含量测定试剂盒检测细胞中CAT的活性及ROS、MDA的含量，按照试剂盒说明书进行逐步操作。

1.2.8 荧光素酶报告基因技术验证miR-615-5p对APOE基因的靶定 扩增APOE mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)全长，连接于pGL3双荧光素酶报告基因载体上；将构建好的载体单独或与miR-615-5p mimic共同转染于APOE4+/-型人胚海马细胞中，孵育72 h，按荧光素酶报告基因分析试剂盒中所述步骤进行操作，以多功能酶标仪检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 散发性AD患者血液中miR-615-5p的表达水平显著下调 实时定量PCR检测18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散发性AD患者血液中miR-615-5p的表达水平，结果显示家族性AD患者血液中miR-615-5p的表达水平与非AD志愿者基本一致(P>0.05)，散发性AD患者血液中miR-615-5 p的表达水平显著低于非AD志愿者(P<0.01)(见图1A)。

2.2 Aβ处理降低AD细胞模型中miR-615-5 p的表达水平 分别以50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42、10 μmol Aβ25-35和等体积PBS(作为对照)处理APOE4+/-型人胚海马细胞(见图1B),Hoechst 33258染色结果所示，对照组中部分细胞内呈现浓染致密颗粒块状荧光(指示凋亡细胞)，KCl 处理后细胞内多呈弥散均匀荧光，而Aβ1-42 或Aβ25-35处理后致密颗粒块状荧光增多(见图1B)。同时实时定量PCR分析结果显示，KCl处理促进细胞中miR-615-5p的表达水平，而Aβ处理降低细胞中miR-615-5p的表达水平(见图1C)。

2.3 miR-615-5p抑制Aβ诱导的APOE4+/-型海马细胞凋亡 在Aβ预处理的APOE4+/-型海马细胞中分别转染miR-615-5p mimic和inhibitor，mimic转染组细胞中miR-615-5 p的表达水平提高至4倍以上(P<0.05)，inhibitor转染组细胞中miR-615-5 p的表达水平下降至30%左右(P<0.05，见图2A)。细胞凋亡检测结果显示，mimic转染组凋亡细胞的比例显著下降，而inhibitor转染组凋亡细胞的比例显著上升(P<0.05，见图2B)；凋亡关键基因表达检测结果显示，mimic转染抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和9的表达，而inhibitor转染则促进caspase-3和9的表达(见图2C)。

2.4 miR-615-5p缓解Aβ诱导的APOE4+/-型海马细胞氧化应激、促进突触生长 分别检测转染后各组细胞中氧化应激标志物水平，结果(见表1)，miR-615-5p mimic转染提高APOE4+/-海马细胞中胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase，CAT)的活性(P<0.05)，减少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的产生(P<0.05)，有助于缓解细胞内氧化应激。此外，免疫印迹定量检测发现miR-615-5p mimic促进突触生长标志因子GAP-43(生长相关蛋白-43，growth associated protein)和Syn(突触素，synaptophysin)的表达(P<0.05)。miR-615-5p inhibitor的作用则与miR-615-5p mimic相反(见表2)。

2.5 miR-615-5p靶向结合并抑制APOE4+/-型海马细胞中APOE4蛋白的表达 我们运用靶基因预测软件TargetScan和miRDB预测到mir-615-5p可结合APOE mRNA的3’UTR区域，随后运用荧光素酶报告基因分析验证二者的结合，转入mir-615-5p mimic后荧光素酶活性降低(见图3A)，表明APOE4是mir-615-5p的靶基因。在APOE4+/-型海马细胞中转染mir-615-5p mimic后，APOE4蛋白表达水平下降，Aβ含量也下降；mir-615-5p inhibitor转染则促进APOE4蛋白的表达，增加Aβ含量(见图3B)。

表1 miR-615-5p表达变化对Aβ25-35预处理的APOE4+/-型人胚海马细胞氧化应激水平的影响

与对照组(Aβ25-35处理组)比较*P<0.05

表2 miR-615-5p表达变化对APOE4+/-型人胚海马细胞突触生长标志因子表达水平的影响

与对照组(Aβ25-35处理组)比较*P<0.05

A.18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散发性AD患者血液中miR-615-5p的表达水平对比；B.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分别处理APOE4+/-型人胚海马细胞24 h后Hoechst 33258染色；C.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分别处理APOE4+/-型人胚海马细胞24 h后miR-615-5p的表达水平变化.与正常(对照)组比较aP<0.05,aaP<0.01

图1 AD患者血液及散发性AD细胞模型中miR-615-5p表达水平的检测

A.60 nmol miR-615-5p mimic和inhibitor分别转染Aβ25-35预处理的APOE4+/-型人胚海马细胞72 h后miR-615-5p的表达水平变化；B.miR-615-5p mimic和inhibitor转染对细胞凋亡的影响；C.miR-615-5p mimic和inhibitor转染后细胞凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的水平变化.与 Aβ25-35处理组比较aP<0.05

图2 miR-615-5p对Aβ预处理的APOE4+/-型海马细胞的凋亡的影响

A.荧光素酶报告基因技术验证miR-615-5p与APOE基因的靶定结合;B.miR-615-5p mimic和inhibitor转染后APOE4+/-型海马细胞中APOE4蛋白和Aβ含量变化

图3 miR-615-5p靶定APOE基因并抑制APOE4+/-型海马细胞中APOE4的表达

3 讨 论

自2007发现迄今，miR-615-5p功能报道多见于内脏癌组织细胞的生长和转移的研究中，被鉴定为具有抑癌作用的miRNA。索耀君等首次探讨miR-615在脊髓源性神经干细胞与运动神经元间的表达特征[14]，发现miR-615在分离的运动神经元中显著高表达，揭开了miR-615在神经系统功能和发育调控研究的序幕。本研究以AD患者和散发性AD细胞模型为研究对象，检测并对比正常、家族性AD和散发性AD老年人血液中miR-615-5p的表达水平，以及APOE4+/-型海马细胞和Aβ诱导的APOE4+/-海马细胞中miR-615-5p的表达水平，散发性AD患者和细胞模型中miR-615-5p的表达水平显著下调，提示miR-615-5p在散发性AD进程中可能发挥调控作用。

AD发病机制在细胞和分子水平主要体现为Aβ等大量积累引起的细胞凋亡增加、氧化应激和炎症水平剧增和神经突触生长抑制[15～17]。在Aβ预处理的APOE4+/-型海马细胞中以转染miR-615-5p mimic和inhibitor的方式过表达或沉默miR-615-5p，发现过表达miR-615-5p显著抑制海马细胞的凋亡和细胞内氧化应激，并促进细胞内突触生长标志因子的表达，而沉默miR-615-5p则对细胞凋亡、氧化应激和突触生长因子表达有相反的结果。因此，本文从正反两方面表明miR-615-5p对散发性AD细胞模型就有保护作用。

众所周知，miRNA的生物学作用由其靶定基因的生物学功能决定。在肝癌细胞中，miR-615-5p通过靶定调节胰岛素样生长因子2抑制癌细胞的增殖和转移[18]；在胰腺癌中和乳腺癌中，miR-615-5p的作用靶点为促进细胞增殖的Akt2基因[12]；最近一项关于非小细胞肺癌的研究证实miR-615-5p可靶定结合并抑制肿瘤坏死因子相关蛋白4基因从而抑制肺癌细胞增殖[19]。APOE4是散发性AD的重要标志，APOE4高表达会加速Aβ进入脑脊液的运输过程，从而加速AD的进程[9,20,21]。本研究以APOE4等位基因为靶点，通过生物信息学工具对miR-615-5p和APOE的调控关系进行预测，TargetScan和miRanda的输出结果均表明APOE是miR-615-5p的潜在靶基因，随后荧光素酶报告基因检测和过表达后APOE4表达检测结果也都证实APOE是miR-615-5p的靶基因，这也揭示了miR-615-5p能够缓解APOE4+/-海马细胞氧化应激和细胞凋亡，并促进细胞突触生长蛋白表达的原因。

综上所述，miR-615-5p在散发性AD患者和细胞模型中表达水平显著下调，可靶定结合并抑制APOE基因表达，从而缓解Aβ25-35诱导的APOE4+/-型海马细胞的凋亡和变性。

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MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells

YAO Jie,MA Qiaoya,YAN Liping,et al.[the First Ward of Cadre Ward

(Department of Aged Neurology),the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710004,China]

Objective Apolipoprotein E4 (apoE4) to explore the regulatory role and mechanism of miR-615-5p in the apoptosis and function of human hippocampus cells.Methods Expression of blood miR-615-5p were detected with real-time qPCR in familial Alzheimer’s disease (AD) patients,sporadic AD patients and non-AD aged volunteers,as well as APOE4+/- human embryonic hippocampus cells and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;the mir-615-5p mimic or inhibitor was transfected into the Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells,and then cell apoptosis,oxidative stress level and synaptic growth protein expression were detected;bioinformatics and luciferase reporter gene analyses were applied to evaluate and validate the targeting relationship between miR-615-5p and APOE4.Results MiR-615-5p was significantly decreased in sporadic AD patients and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;mir-615-5p mimic transfection suppressed cell apoptosis and oxidative stress,and promoted the expression of synaptic growth proteins;in contrast,mir-615-5p inhibitor transfection had an opposite effect; APOE mRNA was targeted by mir-615-5p and APOE4 protein level in APOE4+/-hippocampus cells was suppressed by mir-615-5p mimic transfection.Conclusion MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells.

miR-615-5p; Alzheimer’s disease; APOE4; Cell apoptosis; Oxidative stress

1003-2754(2016)06-0540-05

2016-04-06；

2016-05-30

[西安交通大学第二附属医院干部病房一病区(老年神经科)，陕西 西安 710004]

马巧亚，E-mail：huiqingguohn@163.com

R734.2;Q752;Q291

A