Netrin-1通过下调氧糖剥夺诱导的人神经母细胞瘤自噬促进细胞存活

阙嘉丽， 李晨光， 刘可嘉， 余 剑



Netrin-1通过下调氧糖剥夺诱导的人神经母细胞瘤自噬促进细胞存活

阙嘉丽， 李晨光， 刘可嘉， 余 剑

目的 通过建立体外人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)氧糖剥夺(oxygen and glucose deprication，OGD)模型模拟脑梗死后神经元缺血缺氧环境(OGD)，探索神经导向因子Netrin-1是否影响OGD后细胞的生存，以及自噬在其中的可能作用。方法 体外培养SH-SY5Y细胞，检测Netrin-1对细胞活性及自噬的影响。使用自噬诱导剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预自噬水平，同时构建过表达Netrin-1受体UNC5H2-HA基因的HEK293T细胞；CCK-8试剂盒检测细胞活性，免疫印迹检测自噬相关标志物(Beclin 1、LC3、p62)的表达及免疫荧光检测LC3斑点的形成。结果 与OGD对照组相比，Netrin-1及3-甲基腺嘌呤的干预均显著提高细胞活性，伴有LC3-Ⅱ斑点形成减少；相反，雷帕霉素增加LC3-Ⅱ斑点的同时抑制细胞活性，并减弱了Netrin-1提高细胞活性的作用。过表达UNC5H2-HA细胞较对照质粒组相比，LC3-Ⅱ表达增加；同时进行Netrin-1干预后仅过表达组出现LC3-Ⅱ表达下降，p62表达上升。结论 Netrin-1可能通过受体UNC5H2下调OGD损伤的人神经母细胞瘤自噬而提高细胞活性。

Netrin-1； 氧糖剥夺； 自噬； UNC5H2

脑卒中是导致我国成人残疾和死亡的第一原因[1]。脑梗死后神经元自噬过程被激活，研究发现降低自噬活性能够降低神经元死亡数量，减小梗死面积并促进神经功能恢复[2,3]，但其调节因素尚未完全阐明。作为一种神经导向因子，Netrin-1不仅在发育中神经系统调节细胞迁移黏附[4]，而且在成年后与依赖性受体UNC5H2结合后，显著地减少脑卒中后细胞凋亡，并改善运动功能恢复[5～7]，提示其在脑保护作用上具有治疗潜能。

进一步地研究显示Netrin-1在减少缺血导致心肌细胞死亡的同时也显著地降低了自噬活性[8]，但在脑梗死后尚缺乏两者的研究。

本实验利用稳定表达Netrin-1及其受体UNC5H2的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)建立模拟脑梗死环境的体外氧糖剥夺细胞模型[9,10]，同时构建UNC5H2过表达的HEK 293T细胞系，旨在探讨Netrin-1对缺氧损伤后自噬及细胞活性的调节作用，以及其受体UNC5H2对细胞自噬的影响，为Netrin-1的脑保护作用探寻新的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及建立过表达体系 人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)、HEK 293T细胞购自American Type Culture Collection(ATCC)公司。细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。每2～3 d更换培养液一次，生长达80%融合时传代，取第2-7代细胞分组进行实验。HEK 293T细胞按104/ml的密度种植于六孔板及培养皿中，12 h贴壁后，按Lipofectamine 3000(Life Technologies)说明书步骤瞬转UNC5H2-HA-tag质粒及对照质粒(吉凯生物),使用HA抗体(1∶1000，Abcam)进行免疫荧光法测定转染效率，观察计数100个细胞并计算带绿色荧光的细胞的比例。

1.2 OGD模型建立 该模型用于模拟体内脑梗死环境并进行自噬和细胞活性检测[11]。SH-SY5Y按105/ml正常接种于96孔板后，吸净原有培养基，更换成DMEM无糖培养基(Gibco)，置于含有氧气指示剂(日本三菱)的缺氧罐内，使用真空抽气泵抽空罐内空气后，通入由95%N2及5%CO2组成的混合气体，反复抽吸3次构建缺氧环境，氧气指示剂持续显示粉红色表明缺氧过程成功，最后将缺氧罐放置在37 ℃恒温箱中2 h后置于正常氧糖环境中。

1.3 CCK-8试剂盒检测细胞活性 SH-SY5Y接种于96孔板中，接种密度为105/孔，设6个复孔，培养24 h后细胞贴壁，分别加入以下药物：对照组(不加药)；Netrin-1组(50 ng/ml)；自噬诱导剂雷帕霉素组(Rapamycin,RAPA,50 nmol/L)；Netrin-1+RAPA组；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,1mmol/L)；Netrin-1+3-MA组。药物预处理2 h后置于OGD模型中，2 h后每孔加入10 μl CCK-8(日本同仁)，37 ℃孵育1.5 h后用酶标仪在450 mm波长下进行比色，计算相对吸光度，吸光度越高，细胞活性越高。

1.4 免疫荧光检测自噬标记物LC3斑点形成 SH-SY5Y经100%甲醇固定15 min，0.01 mol PBS摇床洗5 min 3次，加入封闭液封闭1 h后孵育兔抗大鼠LC3一抗(1∶100，CST)检测LC3斑点形成，4 ℃冰箱放置过夜，加入delight 555标记的山羊抗兔荧光二抗(1∶600，CST)室温孵育1 h后再漂洗，封片后于共聚焦显微镜下拍照。

1.5 Western blot HEK 293T细胞用细胞裂解液(博彩生物)提取蛋白，BCA试剂盒(Thermo)进行蛋白定量测定，蛋白样品(每孔40 μg)进行12% SDS-PAGE垂直电泳，恒流转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入兔抗人一抗UNC5B、Beclin 1、p62、LC3及GAPDH，4 ℃孵育过夜，次日加入抗兔二抗室温孵育1 h，加入化学发光HRP底物(Millipore)于荧光化学发光成像分析系统(Image Quant Las4000 mini)中曝光成像，采用Quantity One 分析条带灰值。

2 结 果

2.1 CCK8检测细胞活性 各组经OGD处理后，与OGD对照组(0.63±0.03)相比，Netrin-1组(0.77±0.04)、3-MA组(0.76±0.03)以及3-MA+Netrin-1组(0.77±0.04)明显增强SH-SY5Y活性(P均<0.05)；而RAPA组(0.63±0.01)对细胞活性影响不明显；与Netrin-1组相比，RAPA+Netrin-1组(0.65±0.02)的细胞活性下降(P<0.05)(见图1)，表明50 nmol/L RAPA能够有效减弱OGD后Netrin-1对细胞活性的增强作用，而3-MA对此无明显影响。

2.2 免疫荧光检测LC3斑点形成 微管相关蛋白LC3是自噬标志物。自噬小体形成时，胞浆型LC3即LC3-I与磷脂酰乙醇胺共价结合，形成结合在自噬小体膜上的斑点状LC3-Ⅱ(见图2)。OGD时SH-SY5Y胞质中可见大量LC3斑点形成，RAPA作用后斑点明显增加，但Netrin-1组及3-MA组、Netrin-1+3-MA组则出现斑点数目明显减少，提示Netrin-1减轻SH-SY5Y自噬活性。另外，Netrin-1+RAPA组的斑点数较Netrin-1组增加。

2.3 Western blot 过表达UNC5H2-HA组较对照质粒组LC3-Ⅱ/GAPDH比值增高(P<0.05)；对照质粒组中进行Netrin-1干预对自噬标志物无明显变化，而在UNC5H2-HA组中Netrin-1干预使LC3-Ⅱ相对比值下降，及Beclin 1相对下降，p62相对升高(P<0.05)，提示细胞自噬活性降低(见图3)。

与对照组相比*P<0.05；与Netrin-1组相比#P<0.05

图1 CCK8试剂盒检测细胞活性

A：对照组；B：RAPA组；C：3-MA组；D：Netrin-1组；E：RAPA+Netrin-1组；F：3-MA+Netrin-1组 红色荧光为LC3-Ⅱ蛋白，蓝色荧光为细胞核，1000×，标尺=5μm

图2 LC3免疫荧光染色

A：蛋白泳道从左到右：vehicle组,vehicle组+Netrin-1，UNC5H2-HA组，UNC5H2-HA组+Netrin-1；B：Beclin 1蛋白的相对比值变化；C：p62蛋白的相对比值变化；D：LC3-Ⅱ蛋白的相对比值变化与vehicle对照组相比*P<0.05； 与UNC5H2-HA组相比#P<0.05

图3 过表达UNC5H2-HA及添加Netrin-1后的自噬标志物表达改变

3 讨 论

本实验通过对SH-SY5Y细胞活性和自噬相关标志物LC3的检测，结果发现，OGD后SH-SY5Y自噬增强，细胞活性降低，而给予Netrin-1预处理后，自噬明显减弱并伴细胞活性增强，这种增强作用可被自噬诱导剂RAPA所减弱。另外，过表达UNC5H2的HEK 293T细胞也出现自噬增强，并且Netrin-1仅减弱该过表达系的自噬活性，提示Netrin-1在体外对OGD后的SH-SY5Y生存具有保护作用，且该保护作用可能通过UNC5H2介导降低自噬而实现。

自噬过程与细胞死亡密切相关，并受mTOR、PI3K等多种因素调控，适量的自噬有助于适应外界刺激促进细胞存活，而过量的自噬则有可能加速细胞的死亡[12,13]。脑梗死后早期病灶周围神经元自噬即显著增强，但其作用尚存争议。一般认为这种自噬激活是一种损伤机制[14]。注射自噬抑制剂[10,15]或敲除自噬相关基因Beclin 1[16]后均可减少脑梗死面积并改善神经功能；但也有实验认为自噬激活具有保护作用，在侧脑室注入自噬抑制剂预处理后脑梗死面积反而增大[17]，这可能与所使用的动物模型、药物剂量和观测时间点等不同相关[15,17]。本实验采用的神经源性细胞SH-SY5Y与原代神经元自噬活性相当，采用的50 nmol/L的RAPA和1 mmol/L的3-MA在保留有效调控自噬的同时可尽量避免对细胞造成损伤[18]。在该条件下通过观察OGD后自噬对SH-SY5Y的影响，发现OGD后自噬增强不利于该细胞的生存，而Netrin-1对其生存的促进作用则是通过减弱这种自噬来实现的，表现为LC3的减低和p62的增高。

已经发现过表达Netrin-1能够减少脑缺血导致的神经元死亡并改善神经功能恢复[5～7]，同时，Netrin-1与其依赖性受体UNC5H2结合后能抑制细胞凋亡，促进细胞存活[19]。为进一步了解是否UNC5H2也介导Netrin-1对自噬的调节作用，我们构建了过表达UNC5H2的HEK 293T细胞系，结果发现过表达UNC5H2明显提高细胞的自噬活性，而同时给予Netrin-1干预后可减低这种自噬活性，提示Netrin-1/UNC5H2可能是自噬调节中的重要因素。

有研究发现UNC5在线虫神经元中与自噬相关基因UNC-51及UNC-14密切相关，后两者可协同定位UNC-5的亚细胞结构，并引导神经元生长[20]。另外，Netrin-1/UNC5H2介导的细胞存活的下游分子DAPK[21]也可能通过激活Beclin 1而启动自噬途径[22]，但其机制仍有待进一步阐明。本实验没有检测Netrin-1的其他受体，如DCC、neoginin等，尚不能除外这些受体也在Netrin-1对自噬的调控起作用，这有待于今后深入研究。

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Netrin-1 protects SH-SY5Y neuroblastoma cells from oxygen-glucose deprivation by attenuating autophagy

QUE Jiali,LI Chenguang,LIU Kejia,et al.

(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)

Objective To mimic hypoxic and ischemia environment caused by stroke,in vitro oxygen-glucose deprivation (OGD) model was established.The aim is to explore whether axon guidance factor Netrin-1 protectes SH-SY5Y neuroblastoma cells from OGD by regulating autophagy.Methods SH-SY5Ys were pretreated with Netrin-1 before OGD，apply applied autophagy inducer rapamycin and autophagy inhibitor 3-methyladeni-ne (3-MA) to modulate the autophagy flow,and transient transfected HEK 293T cell with UNC5H2-HA plasmid;cell viability was examined in CCK8 assay,western Western blot detected the autophagy markers (Beclin1,LC3,p62) and immunofluorescence detected punctuate LC3.Results We found that Netrin-1 improved cell viability and decreased the expression of LC3-Ⅱ,a protein related to autophagosome formation,in a manner sensitive to RAPA co-treatment.Additionally,the ability of Netrin-1 to decrease the expression of LC3-Ⅱ was present in UNC5H2-overexpressing HEK 293T cells but not vehivle-transfected cells,indicated the importance of Netrin-1-UNC5H2 interaction to this effect.Conclusion These results indicate that Netrin-1 may improve cell survival by attenuat-ing autophagy via UNC5H2.

Netrin-1; Oxygen-glucose derivation; Autophagy; UNC5H2

1003-2754(2016)06-513-04

2016-02-23；

2016-05-29

国家自然科学基金(No.81371276)；广东省自然科学基金(No.2014A030313065)；广东省重大神经疾病诊治研究重点实验室(No.2014B030301035)

(中山大学附属第一医院神经科，卫生部国家临床重点专科，教育部国家重点专科，广东 广州 510080)

余 剑，E-mail：yujian21cn@163.com

R739.4

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