一株假单胞菌对苋菜红的脱色特性研究

刘 捷, 李湘凌, 邢 进, 胡翠茹, 袁 峰, 周涛发

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)



一株假单胞菌对苋菜红的脱色特性研究

刘 捷, 李湘凌, 邢 进, 胡翠茹, 袁 峰, 周涛发

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

文章以一株假单胞菌Pseudomonassp.为研究对象,考察了该菌作用下碳源种类、葡萄糖质量浓度、初始pH值、染料质量浓度及时间等因素对苋菜红(AR27)偶氮染料的厌氧脱色的影响。研究结果表明生物降解在脱色过程中占主导作用,其脱色过程符合一级反应动力学规律。在单因素实验基础上,利用Box-Benhnken组合实验和响应面分析法对脱色条件进行优化。经修正,得到的最佳脱色条件为：染料质量浓度170 mg/L,葡萄糖质量浓度1.6 g/L,脱色培养液的初始pH值为7.2,脱色时间75 h,此时该菌对偶氮染料AR27的脱色率为97.3%。

假单胞菌;偶氮染料;碳源;响应面法

0 引 言

偶氮染料是分子中具有一个或多个偶氮基(-N=N-)的芳香类化合物。由于其具有颜色范围广、色光良好等优点而成为目前商业应用最多的合成染料[1]。印染、染料等生产行业排放的废水中含有大量的偶氮染料,使得该类废水色度高且具有严重的生态环境危害性[2],其中染料废水的脱色已成为研究热点之一。生物法是偶氮染料废水脱色的较为有效的途径,在好氧条件下大多数偶氮染料较难降解脱色,而在兼氧或厌氧条件下偶氮键易被还原断裂[3-4]使其表现出良好的脱色能力。

近年来,人们已发现多种具有脱色偶氮染料能力的菌株,包括气单胞菌属、光合细菌、芽孢杆菌、大肠杆菌和希瓦氏菌属等。文献[5]从染料废水中分离出一株球形芽孢杆菌Lysinibacillussp. RGS对雷马素红具有较好的脱色效果。文献[6]分离出的菌株Shewanellaaquimarina在高盐偶氮染料废水中对甲基橙的脱色率[7]达79.1%。文献[8]筛选出的产碱杆菌AlkaligenesSpecies AP04是一株好氧菌,它可以以活性红198作为唯一碳源维持生长。文献[8]成功利用菌株Geobacteraceaemetallireducens(DSM 7210)脱色酸性红27,脱色率最高可达93.7%。

本文以苋菜红(AR27)偶氮染料为模式污染物,利用课题组前期从活性污泥中分离出的一株以柠檬酸铁为电子受体能进行异化铁还原的菌株(Pseudomonassp.),研究其脱色特性并优化其脱色条件,以期为细菌在染料废水治理领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 染料

偶氮染料AR27(C20H11N2Na3O10S3),分析纯,相对分子质量为604.47,结构式如图1所示,最大吸收波长为520 nm。

图1 AR27的化学结构式

1.1.2 菌种与培养基

菌种来源于本实验室前期分离出的一株具有异化铁还原能力的菌株,经鉴定该菌为假单胞菌Pseudomonassp.。

活化培养基如下:NaCl 5.0 g/L, MgCl20.1 g/L, CaCl20.1 g/L, KCl 3.0 g/L, KH2PO41.0 g/L, NH4Cl 1.25 g/L, NaNO32.0 g/L,CH3COONa 2.0 g/L, NaHCO32.5 g/L,抗坏血酸0.1 g/L。

脱色培养基如下：C6H12O61.5 g/L, KH2PO42.65 g/L, Na2HPO41.69 g/L,(NH4)2SO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,少量微量元素。

1.1.3 主要仪器

AUY-120型电子天平,KADY便携式pH值计,SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器,SF-VD-650型超净工作台,SHP-250型生化培养箱,HC-2064高速离心机,UV-754型紫外-可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 碳源种类对染料脱色的影响

脱色实验均在250 mL的盐水瓶中进行。在配置好的脱色培养基中加入AR27, 其终质量浓度为150 mg/L,分别投加葡萄糖、乙酸钠、丙酮酸钠、淀粉,各碳源终质量浓度为1.5 g/L。不加碳源的作为对照组。调节pH值至7.0左右,121 ℃下灭菌20 min。按无菌操作法将处于对数生长期的菌株Pseudomonassp.按体积分数为10%的接种量接种至脱色培养基中。然后向培养基中通入高纯N2,吹脱5 min,迅速用胶塞和铝盖密封,将其置于35 ℃的恒温培养箱中反应。脱色前,用灭菌的注射器取样;脱色期间,间隔一定时间用无菌注射器取样,测定AR27的脱色率。实验均设置3个平行样。

1.2.2 葡萄糖质量浓度对染料脱色的影响

向脱色培养基中(含有150 mg/L的AR27)添加葡萄糖,其终质量浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L。调节pH值至7.0左右,121 ℃下灭菌20 min。其余步骤同1.2.1。脱色前,用灭菌的注射器取样;脱色期间,间隔一定时间用无菌注射器取样,测定体系中pH值和AR27的脱色率。实验均设置3个平行样。

1.2.3 体系初始pH值对染料脱色的影响

脱色培养基中葡萄糖质量浓度为1.5 g/L,AR27质量浓度为150 mg/L。用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调节培养基的初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。121 ℃下灭菌20 min,其余步骤同1.2.1。脱色前,用灭菌的注射器取样;脱色期间,间隔一定时间用无菌注射器取样,测定体系中pH值和AR27的脱色率。实验均设置3个平行样。

1.2.4 染料初始质量浓度对染料脱色的影响

脱色培养基中葡萄糖质量浓度为1.5 g/L,向其中添加AR27,使得体系中AR27的终质量浓度分别为50、100、150、200、250、300、400 mg/L。调节pH值至7.0左右,121 ℃下灭菌20 min,其余步骤同1.2.2。用无菌注射器移取脱色前和脱色72 h后的水样,测定AR27的脱色率。实验均设置3个平行样。

1.2.5 响应曲面法优化脱色条件

在单因素实验结果最优水平基础上,根据Box-Behnken设计原理,本实验以脱色率r为响应值,利用Design-Expert 8.0软件设计四因素三水平响应曲面实验[9],选取AR27质量浓度、时间、pH值、葡萄糖质量浓度4个影响因素,因素编码水平见表1所列。

表1 响应面优化实验因素水平

1.2.6 菌体吸附脱色测定

将响应曲面法得到的优化条件进行验证实验,脱色完全后的培养基在8 000 r/min下离心10 min,弃去上清液,收集菌体。将得到的菌体置于甲醇中,利用超声波破碎菌体,并使菌体均匀分布在甲醇溶液中。

然后将混合液静置12 h,4 000 r/min下离心10 min,收集上清液。收集2次上述步骤所得上清液,测定被菌体吸附染料的吸光度,根据AR27标准曲线计算出菌体吸附染料的质量,从而得出吸附率[10]。

1.2.7 染料脱色率测定及计算

将含染料以及菌体的培养液离心后得上清液,以未加染料的菌体培养上清液为参比,在染料相应的最大吸收波长处(520 nm)测量其吸光度。脱色率r的计算公式如下:

其中,A0、At分别为接种后初始时刻和培养t时刻上清液的吸光度。

2 实验结果与讨论

2.1 脱色的基本作用分析

由于菌体对染料具有吸附作用,在本研究中为了确定反应体系中的吸附脱色作用的贡献,采用甲醇洗脱法来研究菌体吸附脱色的情况。研究结果发现,菌体对染料的吸附率仅为(6.3±1.02)%,该吸附脱色率与体系的总脱色率97.3%相比较,吸附脱色作用所占比例很小,因此该体系中的脱色以该菌的生物降解过程为主。

2.2 不同因素对AR27染料脱色的影响

2.2.1 碳源的影响

分别以葡萄糖、乙酸钠、淀粉、丙酮酸钠作为实验组,不添加碳源作为对照组,研究了不同碳源对铁还原菌脱色AR27的影响,如图2所示。

由图2可以看出,当无外加碳源时,AR27缓慢脱色,脱色135 h时AR27体系中脱色率为27.7%,表明该株菌可以利用AR27作为碳源来维持自身代谢并实现缓慢脱色。而目前只发现少量细菌可以以染料为唯一碳源进行生长并使其降解。如KlebsiellapneumoniaeY3可利用甲基红作为唯一碳源维持生长并使其逐渐降解[11],64 h脱色率为52%。

图2 碳源对AR27脱色率的影响

外加葡萄糖、淀粉、丙酮酸钠等碳源都提高了该菌对AR27的脱色率。当脱色反应时间为135 h时,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸钠体系的脱色率均达到了98%左右,与未添加碳源的体系相比较,其脱色率提高了3.5倍左右。而乙酸钠作为外加碳源时,并没有明显促进脱色。同时,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸钠能提高AR27的脱色速度。当脱色反应时间为46 h时,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸钠体系的脱色率分别为80%、51%和41%,而添加乙酸钠体系的脱色率仅为11%,与不添加碳源的体系基本相当。与其他碳源相比较,葡萄糖能快速启动脱色反应,一方面是因为它易于被菌株降解利用,为微生物的生长繁殖提供足够的能量；另一方面是诱导偶氮还原,刺激了负责还原过程的酶系统[12]。

以上结果表明葡萄糖是该菌株脱色AR27的最适碳源，这与乙酸钠可以作为金属还原地杆菌DSM7210脱色AR27的有效碳源[8],甲酸钠是中国希瓦氏菌D14T脱色AR27的最佳碳源[6]的研究结果存在明显的差异,主要原因是该株菌可能是利用发酵糖产生乙酸、氢气等发酵产物的过程中来还原偶氮染料。

2.2.2 葡糖糖质量浓度的影响

葡萄糖是该菌生长的基本物质和脱色AR27的最适碳源,因此研究其在不同质量浓度下脱色效果是十分必要的。AR27质量浓度150 mg/L,pH值为7,不同葡萄糖质量浓度下AR27在72 h时的脱色率如图3所示。

由图3可以看出，葡萄糖的质量浓度低于1.5 g/L时,脱色率随着葡萄糖质量浓度的增加而提高,这是由于葡萄糖质量浓度较低时,电子供体不足导致铁还原菌的脱色能力较差。而当葡萄糖的质量浓度超过1.5 g/L时,它的脱色率有所下降,并且测得此时的脱色体系pH值处于4.5～5.5之间。这可能是因为较高质量浓度的葡萄糖会转化为大量的有机酸,使得培养基pH值大幅降低,抑制了该菌的生长,而该株假单胞菌Pseudomonassp.的最佳生长pH值为7,可见较低的pH值不利于菌株的脱色反应。用NaOH将培养基调节至7左右时,脱色反应又继续进行,脱色率最终能达到95%左右。这种现象与文献[13]研究结果一致。文献[14]指出葡萄糖质量浓度控制在1～2 g/L范围内脱色效率最高,继续提高葡萄糖质量浓度,菌株E2的脱色率会降低。因此,假单胞菌Pseudomonassp.脱色的最佳葡萄糖质量浓度为1.5 g/L,体系pH值是影响脱色反应的关键因素。

图3 葡萄糖质量浓度对AR27脱色的影响

2.2.3 体系初始pH值的影响

葡萄糖质量浓度为1.5 g/L,AR27质量浓度为150 mg/L,不同初始pH值对菌株Pseudomonassp.脱色率的影响如图4所示。从图4可以看出,反应72 h后,pH值为7～9时AR27的脱色率都能达到97%左右;pH值为5和6时脱色率分别为12%、31%,表明酸性条件下不利于脱色反应。且实验过程中测得中性或碱性体系中培养基的pH值减小至6.8左右,而酸性体系的pH值变化不大。造成这种现象的可能原因是菌株Pseudomonassp.对葡萄糖厌氧发酵,产物中的乙酸、丁酸等挥发性脂肪酸,与碱性的培养基发生中和反应,使培养基的pH值降低至接近中性,便于菌体的生长[15],以致在初始pH值为9的碱性条件下AR27仍能保持较高的脱色率。

图4 初始pH值对AR27脱色率的影响

2.2.4 AR27初始质量浓度的影响

葡萄糖质量浓度为1.5 g/L,pH值为7,不同AR27初始质量浓度对菌株Pseudomonassp.脱色率的影响如图5所示。

图5 AR27初始质量浓度对其脱色率的影响

从图5可以看出,脱色时间为72 h时,AR27的初始质量浓度不超过200 mg/L,脱色效果较好,脱色率达90%左右。而当初始质量浓度超过200 mg/L时,脱色率随着染料质量浓度的增加而减小,这可能是高质量浓度染料对该菌具有毒副作用,其中偶氮染料芳环上的磺酸基团的抑制微生物的生长,降低了微生物的脱色率[16],或者是不合适的细胞/染料比造成的[17-20]。印染行业废水中的染料质量浓度[21]通常为10～200 mg/L,本研究中的菌株对具有在实际染料废水的高效厌氧脱色中的应用有一定的潜力。

2.3 不同碳源条件下染料的脱色动力学分析

动力学研究是厌氧降解有机物研究的重要内容之一,通过对脱色动力学的研究可计算出脱色反应速率,为更好地应用于实际染料废水提供参考依据。

采用一级反应动力学方程[22]对不同碳源条件下AR27的吸光度与反应时间进行拟合,得到动力学方程和相关参数见表2所列。

表2 不同碳源条件下AR27的脱色动力学参数

由表2可看出,不同碳源条件下AR27脱色均符合一级反应动力学规律,且相关性良好。添加葡萄糖、丙酮酸钠、淀粉和乙酸钠等碳源以及不添加碳源时,各体系中的染料脱色速率常数分别为0.073 4、0.047 8、0.033 4、0.004 8、0.002 6,从脱色速率常数进一步说明了添加葡萄糖能显著提高该菌株对AR27的脱色速率。当葡萄糖、丙酮酸钠、淀粉和乙酸钠作碳源时AR27的脱色半衰期分别为9.44、14.50、20.75、144.41 h,当不添加碳源、菌株以偶氮染料为碳源时AR27的半衰期为266.59 h。

2.4 响应面脱色条件优化实验结果

采用Box-Behnken模型,以表现显著的AR27质量浓度(A)、葡萄糖质量浓度(B)、pH值(C)、脱色时间(D)作为自变量,脱色率(r)为响应值设计29组试验，实验设计与结果见表3所列。

表3 响应面实验设计及结果

根据表3的实验结果,经回归拟合实验数据所得经验模型为:

r=96.02+1.86A+4.36B+5.44C+

3.16D+1.25AB+0.35AC-0.68AD-

3.78BC+1.7BD-2.7CD-2.27A2-

8.42B2-5.4C2-2.85D2。

用Design-Expert8.0对模型进行方差分析,结果见表4所列，其二次回归方程的方差分析见表5所列。从表4中可知,模型显著,失拟项不显著。从表5中可知,该模型的复相关系数R2=0.976 6,说明该模型能较好地描述实验结果。它的变异系数为1.76,低于10%,说明该实验的稳定性较好。最后得出菌株Pseudomonassp.脱色的最佳条件为:AR27质量浓度为172.06 mg/L,葡萄糖质量浓度为1.63 g/L,脱色培养液的初始pH值为7.16,脱色时间为77.15 h,此时该菌对AR27的预测脱色率达98.5%。

表4 响应面结果的方差分析

为了检验响应曲面设计所得结果的可靠性,同时考虑到实际操作的可行性,将实验参数修正如下：AR27质量浓度为170 mg/L,葡萄糖的质量浓度为1.6 g/L,脱色培养液的初始pH值为7.2,脱色时间为75 h。在该修正条件下进行3次平行实验,得到脱色率的平均值为97.3%,与预测值相差1.2%,与理论值基本吻合。说明该实验设计与响应曲面法优化得到的脱色参数准确可靠,具有实际应用价值。

表5 二次回归方程的方差分析

3 结 论

(1) 假单胞菌Pseudomonassp.脱色苋菜红AR27是以生物降解为主,且苋菜红AR27脱色过程符合一级反应动力学规律。

(2) 菌株能以苋菜红为碳源维持自身生长并使其脱色。外加葡萄糖、丙酮酸钠和淀粉不仅能提高脱色率,也能显著提高脱色速率,其中葡萄糖是该菌株的最佳碳源,其最佳质量浓度为1.5 g/L左右。

(3) 菌株以葡萄糖为碳源,在pH值为7～9环境下,染料的初始质量浓度低于200 mg/L，均表现出良好的脱色能力。

(4) 采用响应曲面法得到的最优化脱色条件为:AR27质量浓度170 mg/L,葡萄糖质量浓度1.6 g/L,脱色培养液的初始pH值为7.2,脱色时间为75 h,在该脱色条件下，AR27的脱色率达到了97.3%。

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(责任编辑 闫杏丽)

Characterization of decolorization of amaranth byPseudomonassp. strain

LIU Jie, LI Xiangling, XING Jin, HU Cuiru, YUAN Feng, ZHOU Taofa

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of factors like carbon sources, initial concentrations of glucose and azo dye, initial pH value and time on the amaranth(AR27) anaerobic decolorization byPseudomonassp. strain was investigated. The results indicated that the biodegradation played the dominant role in the decolorization, and the kinetics of decolorization reaction was corresponding with the first order reaction kinetics models. Based on the single factor experiment, the decolorization was optimized by using the Box-Benhnken composite designing and response surface methodology. After amendment, the rate of decolorization of AR27 byPseudomonassp. strain reached 97.3% under the optimal parameters with AR27 of 170 mg/L and glucose of 1.6 g/L cultivating for 75 h at pH value of 7.2.

Pseudomonassp.; azo dye; carbon source; response surface methodology

2015-10-14；

2015-11-27

安徽省国土资源科技资助项目(2015-g-8)

刘 捷(1989-),女,湖北麻城人,合肥工业大学硕士生; 袁 峰(1971-),男，广西桂林人，博士，合肥工业大学教授，博士生导师； 周涛发(1964-)，男，安徽庐江人，博士，合肥工业大学教授，博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.11.023

X172

A

1003-5060(2016)11-1556-07