牛膝各拆分组分的抗炎活性研究

杨柳，颜美玲，吴丽红，姜海，舒尊鹏，杨大宇，杨炳友，王秋红，匡海学

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)



牛膝各拆分组分的抗炎活性研究

杨柳，颜美玲，吴丽红，姜海，舒尊鹏，杨大宇，杨炳友，王秋红，匡海学*

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究牛膝各拆分组分的抗炎活性。方法：建立醋酸所致小鼠腹腔炎症渗出模型和角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀模型，考察牛膝各拆分组分的抗炎活性。结果：在醋酸所致小鼠腹腔炎症渗出模型中，牛膝甾酮组分高剂量组和牛膝皂苷组分高、中、低三个剂量组均有不同程度抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的作用，其中皂苷组分三个剂量组的抑制作用呈剂量依赖性；在角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀模型中，牛膝甾酮组分和皂苷组分各剂量在相应时间点上都可以有效降低角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀率，以牛膝甾酮组分高剂量和皂苷组分高、中剂量组的抑制效果最佳。结论：牛膝甾酮组分和皂苷组分都具有一定的抗炎作用，是牛膝药材发挥抗炎作用的药效物质基础。

牛膝；甾酮；皂苷；抗炎

牛膝为我国传统中药，是中医临床的常用药，始载于《神农本草经》，陶弘景释名为“其茎有节似牛膝”，即药名相形之义。牛膝主产于河南，并且在河南有着悠久的种植历史，目前河南是牛膝的道地药材产区。牛膝性平，其味酸、苦，归肝、肾经，具有强筋骨，补肝肾，活血通经，利尿通淋，引血(火)下行等功效。生用可活血祛瘀，熟用可补肝肾、强筋骨[1-2]。通过化学成分研究发现，牛膝中含有大量的甾酮类和皂苷类化合物[3-10]，这两类化合物具有多种药理作用[11-15]。前期研究结果发现，牛膝补肾壮骨有效部位既能够治疗骨质疏松，又能够促进开放性骨折的愈合，同时还能对骨折所引起的炎症反应起到一定的抑制作用[16]。为了进一步阐述牛膝补肾壮骨有效部位中甾酮类和皂苷类化合物在抗炎方面所发挥的作用，本实验在牛膝补肾壮骨有效部位化学成分已拆分的基础上[17-18]，对牛膝甾酮组分和牛膝皂苷组分进行了抗炎活性的研究，考察牛膝各组分能否对由骨折引起的急性炎症发挥抗炎作用。

1 材料

1.1 动物

昆明种小白鼠，雄性，体质量(20±2)g，合格证号：SYXK黑2013003，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。SD大白鼠，雄性，体质量(200±20)g，合格证号：SYXK黑2013003，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。

1.2 试剂和仪器

牛膝各拆分组分(黑龙江中医药大学药学院中药化学研究室自行制备)；依文思蓝(美国Amresco公司)；醋酸地塞米松片(哈药集团三精制药有限公司)；生理盐水(哈尔滨三联药业有限公司)；碘伏(德州益家康消毒有限公司)；角叉菜胶(美国Sigma-Aldrich 公司)；721型紫外分光光度计(上海光学仪器厂)；毛细管放大装置(黑龙江中医药大学药学院中药化学教研室自行制备)；TGL-16型离心机(上海医疗器械厂)；精密天平(BL-P系列美国Setra电子公司)。

2 方法

2.1 牛膝各拆分组分对醋酸所致毛细血管通透性的影响

2.1.1 实验分组及给药方法

取昆明种小鼠80只，体质量(20±2)g，雄性，随机分为8组，每组10只，分别为空白对照组、地塞米松阳性对照药组(6 mg/kg)、牛膝甾体高剂量组(51 mg/kg)、中剂量组(26 mg/kg)、低剂量组(13 mg/kg)，牛膝皂苷高剂量组(75 mg/kg)、中剂量组(37 mg/kg)、低剂量组(19 mg/kg)。各组均连续灌胃给药7天，每天1次，空白对照组给予同体积蒸馏水。

2.1.2 实验方法与观测指标

各组均连续灌胃给药7天，末次给药2 h后，各鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液，按0.1 ml/10 g给药，并立即腹腔注射0.6%醋酸。致炎后20 min脱椎处死小鼠，打开腹腔，用6 ml的生理盐水分多次冲洗小鼠腹腔，吸出洗涤液后加生理盐水至10 ml，3500 rpm离心15 min取上清，用比色法于590 nm波长处测定OD值，以生理盐水溶液调零读取吸光度A值，以A值表示伊文思蓝含量。

0.5%伊文思蓝的配制：精确称取伊文思蓝0.125 g，用生理盐水溶解，定容至25 ml容量瓶，得到0.5%伊文思蓝生理盐水溶液。

2.2 牛膝各拆分组分对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

2.2.1 实验分组及给药方法

取健康SD大鼠80只，体质量(200±20)g，雄性，随机分为8组，每组10只，分别为空白对照组、阳性药醋酸地塞米松(4.2 mg/kg)组、牛膝甾体高剂量组(36 mg/kg)、中剂量组(18 mg/kg)、低剂量组(9 mg/kg)，牛膝皂苷高剂量组(52 mg/kg)、中剂量组(26 mg/kg)、低剂量组(13 mg/kg)。各组均连续灌胃给药7天，每天1次，空白对照组给予同体积蒸馏水。

2.2.2 实验方法与观测指标

采用容积测量法，末次给药后在每只大鼠右后支踝关节处用苦味素画一条清晰横线，先测出各组大鼠正常的足趾体积。末次给药 30 min 后，将大鼠右后肢拉直，自足趾中部皮下注射1%角叉菜胶，0.05 ml/爪，诱发足趾炎性肿胀。并在致炎后1 h、2 h、4 h、6 h分别测定各鼠右足趾体积(ml)，计算各组不同时间的足趾肿胀率并比较各组肿胀率的差异。

肿胀率(%)=(肿胀后容积-肿胀前容积)/肿胀前容积×100%

3 结果

3.1 对醋酸所致毛细血管通透性的影响 见表1。

表1 牛膝各拆分组分对醋酸所致小鼠毛细血管通透性的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实验结果见表1。同空白组比较，牛膝甾酮高剂量组、牛膝皂苷高剂量组、牛膝皂苷中剂量组的吸光度值与空白组比较有显著性差异，差异极显著(P<0.01)，牛膝皂苷低剂量组与空白组比较，具有显著性差异(P<0.05)。说明牛膝皂苷高、中、低三个剂量组都有不同程度的抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的作用，牛膝甾酮高剂量组有抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的作用。结果表明牛膝甾酮和皂苷组分都具有一定的抑制炎症因子渗出的作用，其中牛膝皂苷组分的抗炎作用优于甾酮组分。

3.2 对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

实验结果见表2。与空白对照组相比，牛膝皂苷高、中剂量、甾酮高剂量组和阳性药醋酸地塞米松组可明显降低角叉菜胶致炎后1、2、4、6 h大鼠足肿胀率，具有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，抗炎作用较强。牛膝皂苷中剂量组在个别时间点抗炎作用优于皂苷高剂量组，说明牛膝皂苷组分的抗炎作用与剂量无依赖性关系。两组分组间比较,牛膝皂苷组分在急性抗炎作用上优于甾酮组分。

表2 牛膝各拆分组分对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

骨折部位均伴生炎症反应，炎症反应是机体最基本的抗损伤反应。对于开放性骨折而言，炎症会延缓骨折的早期愈合，因为伤口处会发生渗出性炎症，这就会在局部形成红、肿、热、痛的现象，使得局部血流受阻，并使组织缺氧缺血。本实验采用了非特异性炎症模型中的毛细血管通透性增强模型和足跖肿胀模型，来模拟骨折发生后的炎症渗出和局部肿胀，考察了牛膝甾酮组分和牛膝皂苷组分的抗炎作用。毛细血管通透性增强模型是以冰醋酸为致炎物质，进行腹腔注射，给予药物干预作用后，收集染料部位，进行紫外测定[19]。实验结果表明，牛膝皂苷各剂量组和牛膝甾酮高剂量组均具有抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的作用。足跖肿胀模型是以足跖肿胀的体积差异程度作为抗炎活性的评价指标，在大鼠足跖部位皮下注射角叉菜胶作为致炎物质，比较给予药物干预前后足跖肿胀体积差异的程度[20]。实验结果显示，牛膝皂苷高、中剂量组和牛膝甾酮高剂量组可明显减轻角叉菜胶致炎后各时间点大鼠足跖肿胀程度，降低肿胀率。通过以上的实验结果证明，牛膝甾酮和皂苷组分对于炎症渗出和炎症引发的局部肿胀都具有较好的抑制作用。可见在骨折发生时，牛膝各拆分组分能够降低骨折局部毛细血管的通透性，减少炎症物质渗出，抑制骨折局部肿胀，从而促进血管重建，加速局部血运障碍的恢复。

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Anti-inflammatory Effect of Split Fractions of Radix Achyranthis Bidentatae

YANG Liu,YAN Mei-ling,WU Li-hong,JIANG Hai,SHU Zun-peng,YANG Da-yu,YANG Bing-you,WANG Qiu-hong,KUANG Hai-xue*

(KeyLaboratoryofChineseMateria,MedicaMinistryofEducation，HeilongjiangKeyLaboratoryofTCMPharmacidynamicMaterialBases，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective: To research the anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae. Methods: The models of celiac inflammation effusion mice caused by acetic acid and rats’ foot swelling caused by carageen glue were established to observe the anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae. Results:Phytosterones components in high-dose group and tritepene saponins components in three dose groups could inhibit blood capillary permeability of abdominal cavity in the model of celiac inflammation effusion mice caused by acetic acid. In three dose groups the tritepene saponins components showed an anti-inflammatory effect in a dose-dependent manner. Phytosterones components in high-dose group and tritepene saponins components in high and middle dose groups could inhibit the rats’ foot swelling caused by carageen glue. Conclusion: There is an obviously anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae.

Radix Achyranthis Bidentatae; Phytosterones; Tritepene saponins; Anti-inflammation

黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划(2012)；黑龙江省博士后基金项目(No.LBH-Z10020)；黑龙江中医药大学博士创新基金项目(No.2013bs04)；黑龙江省自然科学基金面上项目(No.H201324)；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类项目(No.20132327120003)

杨柳(1982-)，女，副教授，主要研究方向：中药、天然药物药效物质基础及药动学研究。

匡海学*(1955-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药及天然药物药效物质基础、中药性味理论研究。

2016-01-10

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0008-03

修回日期：2016-02-05