生长因子受体结合蛋白2表达与结直肠癌进展和预后的相关性

康争春， 梁 涵， 李 勃， 刘 岩， 蔡 慧， 马立业*

1. 第二军医大学长海医院胃肠外科，上海 200433 2. 第二军医大学热带医学和公共卫生学系环境卫生学教研室，上海 2004333. 北戴河疗养院，秦皇岛 066100



·论 著·

生长因子受体结合蛋白2表达与结直肠癌进展和预后的相关性

康争春1△， 梁 涵2△， 李 勃3， 刘 岩2， 蔡 慧1， 马立业1*

1. 第二军医大学长海医院胃肠外科，上海 200433 2. 第二军医大学热带医学和公共卫生学系环境卫生学教研室，上海 2004333. 北戴河疗养院，秦皇岛 066100

目的： 评价生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)表达水平与结直肠癌进展及预后的关系。方法： 对Grb2的蛋白表达及细胞定位进行免疫组化检测。用t检验、chi-square检验等分析Grb2的表达与年龄、性别、肿瘤部位、分化等级、淋巴结转移个数、TNM分期、辅助化疗、血清癌胚抗原(CEA)和血清 CA19-9之间的关系。用Kaplan-Meier法分析Grb2的表达水平对患者生存率的影响；用Cox回归分析结直肠癌预后的影响因素。结果： Grb2主要表达于结直肠癌上皮细胞的胞质。结直肠癌组织中胞质Grb2的表达显著高于腺瘤和癌旁组织(P<0.05)，而结肠癌组织、腺瘤、癌旁组织中胞核Grb2中的表达水平差异无统计学意义。癌上皮细胞胞质中Grb2高表达与年龄、性别、肿瘤部位、分化等级、TNM分期、辅助化疗、血清CEA、血清CA19-9之间均无相关性，Grb2表达与淋巴结转移个数有相关性(P=0.001)。Cox单因素分析发现，胞质Grb2高表达能预测患者的不良预后；进一步纳入TNM等指标，Cox多因素分析发现，Grb2是结直肠癌预后的独立影响因素[无瘤生存风险比(HR)=2.664，P=0.015；总体生存风险比(HR)=2.574，P=0.019]。结论： Grb2高表达与结直肠癌进展密切相关，是结直肠癌预后的独立危险因素。

结直肠癌；生长因子受体结合蛋白2；不良预后

结直肠癌严重威胁人类生命健康，每年约有120万的患者被诊断为结直肠癌，60多万患者死于该病。男性的发病率高于女性，且随着年龄的增长而增加。大多数结直肠癌呈散发性，发展缓慢，常由腺瘤逐渐发展而来。目前结直肠癌最有效的治疗方法为手术[1-2]。然而，20%～25%的结直肠癌患者确诊时已发生远处转移，20%～25%的结直肠癌患者治疗后仍会发生远处转移，导致结直肠癌患者病死率达45%[3]。术后辅助化疗可有效减少患者复发，但过度化疗又易引起化疗相关不良反应。因此，寻找结直肠癌的有效标志物并作为诊断依据对在疾病早期给予患者合理治疗尤为重要。

目前，结直肠癌的预后和辅助治疗主要依据其病理分期来确定。然而，相同分期患者的预后不尽相同。10%～20%的Ⅱ期结直肠癌患者和30%～40%的Ⅲ期患者在治疗后会复发[4]。近年来发现了多种可以反映结直肠癌特性且能有效预测其预后的分子标志物，但因这些标志物特异性较差而未能用于临床实践。因此，亟需寻找特异性较好且能够反映临床疗效的分子标志物。

生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)是一种广泛表达于各种细胞的衔接蛋白，主要参与调控酪氨酸激酶受体信号通路。Grb2水平的异常与肿瘤的进展密切相关[5]。何政等[6]用real-time PCR和Western印记检测胰腺癌细胞株中的Grb2基因及蛋白后发现，Grb2与胰腺癌恶性程度及预后密切相关。魏希锋等[7]及李旭东等[8]应用免疫组织化学法发现，Grb2表达的高低与膀胱移行细胞癌的病理分级、临床分期有关。Zhang等[9]发现，Grb2是miR-411-5p的直接靶点，敲除Grb2可以抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭；Grb2在乳腺癌中呈现高表达，且其高表达与乳腺癌患者不良预后密切相关；于观贞等[10-11]通过免疫组织化学法发现，Grb2与胃癌的发生、发展及预后密切相关；陈丽妹等[12]研究发现，封闭Grb2可造成结直肠癌细胞内增殖相关信号通路的分子表达下调。Grb2对胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤均有重要的预后价值。但是，目前尚缺乏样本量较多、病例资料较完整、随访时间较长的研究报道结直肠癌中Grb2蛋白水平与结直肠癌进展及预后的关系。本研究通过分析第二军医大学长海医院收治的结直肠癌患者较为完整的病例、标本资料，进一步探讨Grb2与结直肠癌进展及预后的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2001年1月至2009年12月在第二军医大学长海医院普通外科行结直肠癌根治术的341例患者。纳入标准：(1)术前未合并其他部位恶性肿瘤；(2)术后病理证实为结直肠癌，病理分期为Ⅰ～Ⅲ期，患者的结直肠癌组织样本经甲醛固定、石蜡包埋；(3)手术根治性切除肿瘤，术后生存期大于1个月，未发生围术期并发症；(4)有完整规范的术后病理报告及随访资料。选取341例患者的癌组织样本，其中37例患者的癌组织周围正常黏膜的石蜡样本作为对照。341例结直肠癌患者中，男性191例、女性150例，男性∶女性=1.3∶1；平均年龄(60±13.0)岁。341例标本中，Ⅰ期32例，Ⅱ期155例，Ⅲ期154例。同时选取51例因结肠腺瘤于第二军医大学长海医院行手术切除手术患者的瘤组织样本，经甲醛固定、石蜡包埋。

1.2 观察指标 分析入组患者的年龄、性别、肿瘤位置、清扫淋巴结数目、TNM分期(按照美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟结直肠癌TNM分期系统第7版进行)、肿瘤细胞分化程度、术前血清癌胚抗原(CEA)浓度、血清癌抗原19-9(CA19-9)浓度、术后是否行FOLFOX化疗方案。术后复发：局部复发包括局部淋巴结复发、吻合口复发等；远处复发包括血路转移(如肝、肺等)、腹腔种植转移等。术后复发诊断主要依据体格检查、影像学检查及内镜检查。随访开始于患者出院，终于患者死亡；随访截止时间为2015年10月。

1.3 免疫组化

1.3.1 方法 甲醛固定、石蜡包埋的标本经上海芯超生物科技有限公司制作成组织芯片。组织芯片的免疫组织化学染色由第二军医大学长海医院病理实验中心完成。组织芯片置于二甲苯中脱蜡后，经一系列不同浓度的乙醇浸泡水化，然后放入3%的过氧化氢(H2O2)溶液中以消除过氧化物酶活性。组织芯片经蒸馏水冲洗后，置入柠檬酸缓冲剂中，98℃煮25 min，使Grb2的抗原位点暴露。然后将组织芯片放入体积浓度为20%的山羊血清中孵育，封闭非特异性位点，再用一抗(1∶150, #1517-1, Epitomics公司, 美国)、二抗(Dako公司, 加拿大)分别37℃孵育30 min，其间用PBS漂洗3次，每次5 min。上述步骤结束后，在组织芯片中加入显色剂显色15 min，用自来水充分冲洗，用苏木精复染，脱水，加入中性树胶封片。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料采用t检验，计数资料采用chi-square检验或双侧Fisher精确检验，分类变量采用Mann-WhitneyU检验。采用Kaplan-Meier法分析Grb2高表达组与低表达组的生存率差异；采用Cox单因素和多因素回归分析法分析结直肠癌预后的影响因素。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 结直肠癌组织中Grb2的表达 免疫组化检测发现，Grb2在癌旁组织、腺瘤组织、结直肠癌组织呈不同程度的染色(图1)。Grb2主要在上皮细胞表达，而间质表达量较少。癌旁组织胞核Grb2的阳性率为48.6%(18/37)，腺瘤组织胞核Grb2的阳性率为56.9%(29/51)，癌组织胞核Grb2的阳性率为49.6%(169/341)；癌旁组织胞质Grb2的阳性率为5.4%(2/37)，腺瘤组织胞质Grb2的阳性率为21.6%(11/51)，癌组织胞质Grb2的阳性率为73.9%(252/341)。癌旁、腺瘤、结直肠癌组织胞核Grb2的表达差异无统计学意义,胞质Grb2的表达差异有统计学意义(P<0.05，图2)。因此，以下研究均仅采用胞质Grb2。

图1 癌旁组织、腺瘤组织、结直肠癌组织中Grb2免疫组化染色(×200)

图2 癌旁、腺瘤、结直肠癌组织胞质、胞核Grb2表达比较

2.2 结直肠癌组织中Grb2表达与临床病理因素的关系 免疫组化评估(表1)发现，341例结直肠癌组织中，98例胞质Grb2高表达，243例胞质Grb2低表达；胞质Grb2的表达情况可能与淋巴结转移个数有关(P=0.001)，与年龄、性别、肿瘤部位、分化等级、TNM分期、辅助化疗、血清 CEA和血清 CA19-9无相关性。

表1 结直肠癌胞质Grb2表达与临床病理因素的关系

2.3 Grb2的表达水平与结直肠癌预后的关系

2.3.1 胞质Grb2高表达组和低表达组患者的生存曲线 采用Kaplan-Meier法分析胞质Grb2高、低表达组无瘤生存率及总体生存率差异，发现在不同的TNM分期，胞质Grb2高表达组均较低表达组无瘤生存率低、预后差(P<0.05)(图3A～3C)；在不同的TNM分期，胞质Grb2高表达组均较低表达组总生存率低、预后差(P<0.05)(图3D～3F)。

图3 胞质Grb2高表达组与低表达组患者的生存曲线

A：Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期结直肠癌患者无瘤生存曲线；B：Ⅰ+Ⅱ期结直肠癌患者无瘤生存曲线；C：Ⅲ期结直肠癌患者无瘤生存曲线；D：Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期结直肠癌患者总体生存曲线；E：Ⅰ+Ⅱ期结直肠癌患者总体生存曲线；F：Ⅲ期结直肠癌患者总体生存曲线

2.3.2 结直肠癌预后影响因素的Cox单因素和多因素分析 患者总体生存期的Cox单因素分析显示，胞质Grb2表达水平(P=0.005)、淋巴结转移个数(P=0.029)是结直肠癌预后的影响因素，而TNM分期、分化等级、辅助化疗、年龄、性别、肿瘤部位、血清CEA和血清CA19-9不是结直肠癌预后的影响因素；Cox多因素分析显示，胞质Grb2表达水平是结直肠癌预后的独立影响因素(P=0.019)，TNM分期、分化等级、辅助化疗、年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移个数、血清 CEA和血清 CA19-9不是预后的独立影响因素(表2)。患者无瘤生存期的Cox单因素分析显示，胞质Grb2表达水平(P=0.005)、淋巴结转移个数(P=0.035)是结直肠癌预后的影响因素，而TNM分期、分化等级、辅助化疗、年龄、性别、肿瘤部位、血清CEA和血清 CA19-9不是结直肠癌预后的影响因素；Cox多因素分析显示，胞质Grb2表达水平(P=0.015)是结直肠癌预后的独立影响因素，TNM分期、分化等级、辅助化疗、年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移个数、血清 CEA和血清CA19-9不是结直肠癌预后的独立影响因素(表3)。

表2 结直肠癌患者总体生存期的影响因素

表3结直肠癌患者无瘤生存期的影响因素

3 讨 论

Grb2主要通过调控受体酪氨酸激酶信号通路而调控细胞生长、增殖、分化等生理功能，其异常表达可促进肿瘤进展。目前研究发现，Grb2和多种恶性肿瘤进展及预后关系密切。Li等[13]通过免疫组织化学法发现，Grb2蛋白在食管鳞状细胞癌组织胞质中呈高表达，并且提示不良预后。本研究发现，与癌旁结直肠组织及腺瘤组织相比，结直肠癌组织中Grb2蛋白高表达，并且胞质阳性率高于胞核，差异有统计学意义(P<0.05)。赵廷宽等[14]研究发现，胆管癌Grb2蛋白高表达的患者易发生淋巴转移及远处转移，推测Grb2可能与肿瘤的侵袭、转移相关。研究[15]则证实，结直肠癌中Grb2蛋白高表达可能促进肿瘤的生长、侵袭及转移。本研究发现，Grb2表达与淋巴结转移个数有相关性(P=0.001)，而与年龄、性别、肿瘤部位、分化等级、TNM分期、辅助化疗、血清CEA和血清CA19-9无相关性；Grb2蛋白高表达组患者术后复发时间短于低表达组，Grb2蛋白高表达组生存率低于低表达组，提示Grb2蛋白可能对结直肠癌患者的远期生存有预测作用。

甘肃省临泽县辖鸭暖、倪家营2乡，新华、蓼泉、板桥、平川、沙河 5镇，74个村，765个村民小组，总人口14.63万人，其中农业人口12.52万人，占总人口的86%。近年，临泽县在各级政府高度重视和有关部门的大力支持配合下，着力解决农村饮水卫生、供水量不足等问题，取得了显著成效。截至目前，全县已建成农村集中供水工程34项，解决了44个村1.8万户6.92万人的饮水问题。

Grb2蛋白作为信号通路中的关键蛋白，近几年受到广泛关注。针对Grb2蛋白的靶点治疗是目前研究的热点。针对Grb2抑制剂的研究均取得了较好的进展。封闭Grb2后，结直肠癌细胞内增殖相关信号通路的分子表达下调[12]；有研究研制出针对其信使RNA的抑制剂，发现其也可抑制癌细胞增殖[16]。在关于Grb2的SH2和SH3结构域的研究中，Burke等[17]发现，针对其SH2结构域的抑制剂可降低乳腺癌细胞的增殖速度；Guan等[18]发现，针对其SH3结构域的抑制剂可以逆转结直肠癌细胞的多药耐药性。

本研究样本量较大、病例资料较完整、随访时间较长，但由于缺乏克隆形成、细胞增殖等实验数据，无法深入论证Grb2与结直肠癌的相关性及Grb2的作用机制。但本研究仍为进一步论证Grb2与结直肠癌的关系提供了依据。

综上所述，近年来，有关结直肠癌早期诊断的生物标志物研究较多，但均缺乏特异性，临床应用价值较低。本次研究中，Cox单因素分析显示，胞质Grb2高表达能预测结直肠癌患者的不良预后；进一步纳入TNM等指标，Cox多因素分析显示，Grb2是结直肠癌患者总生存期、无瘤生存期的独立影响因素(P<0.05)，而TNM分期、分化等级、辅助化疗、年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移个数、血清 CEA和血清CA19-9不是结直肠癌患者预后的独立影响因素。本研究提示，Grb2蛋白在结直肠癌中高表达，与不良预后密切相关。Grb2蛋白有希望成为预测结直肠癌侵袭及转移新的生物标志物。

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[本文编辑] 姬静芳

The relationship between growth factor receptor-bound protein 2 expression and the progression and prognosis of colorectal cancer

KANG Zheng-chun1△, LIANG Han2△, LI Bo3, LIU Yan2, CAI Hui1, MA Li-ye1*

1. Department of Gastrointestinal Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 2. Department of Environmental Hygiene, Faculty of Tropical Medicine and Public Health, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 3. Beidaihe Sanatorium, Qinhuangdao 066100, Hebei, China

Objective： To evaluate the correlation between growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) expression and the progression and prognosis of colorectal cancer. Methods： Grb2 expression and its location were detected by immunohistochemisty. The relationship between Grb2 expression and clinicopathologic factors (including age, sex, tumor location, differentiation grade, number of metastatic lymph nodes, TNM staging, adjuvant chemotherapy, serum carcinoembryonic antigen (CEA) and serum CA19-9 were analyzed by t-test, chi-square test and so on. Kaplan-Meier method was used to analyze the influence of Grb2 expression on the survival rate of patients, and Cox regression analysis was used to analyze factors contributing to prognosis of colorectal cancer. Results： Grb2 was mainly expressed in the cytoplasm of colorectal cancer epithelial cells. The expression of cytoplasmic Grb2 in colorectal cancer was significantly higher than that in adenoma and adjacent tissues (P<0.05), while there was no significant difference in nucleic Grb2. There was no correlation between cytoplasmic Grb2 expression and such clinicopathologic factors as age, sex, tumor location, differentiation grade, TNM staging, adjuvant chemotherapy, serum CEA and serum CA19-9, but correlation between Grb2 expression and the number of metastatic lymph nodes(P=0.001). Cox univariate analysis showed that high expression of cytoplasmic Grb2 may predict poor prognosis; after indices such as TNM were included, Cox multivariate analysis showed that Grb2 is an independent prognostic factor for colorectal cancer: its high expression predicted a shorter disease-free survival (HR=2.664,P=0.015) and overall survival (HR =2.574,P=0.019). Conclusions： The high expression of Grb2 is closely related to the progression of colorectal cancer, and it is an independent risk factor for colorectal cancer prognosis.

colorectal cancer; growth factor receptor-bound protein 2; poor prognosis

2016-01-29 [接受日期] 2016-08-18

国家自然科学基金青年科学基金(81402433),中国博士后科学基金(2015T81088).Supported by National Natural Youth Science Foundation of China(81402433),and China Postdoctoral Science Foundation(2015T81088).

康争春, 硕士生. E-mail: ytrkzc@163.com; 梁 涵, 硕士生. E-mail: 15026966839@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160103

R 735.3

A

△共同第一作者(Co-first authors).

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-31161591, E-mail: malydr@163.com