肿瘤干细胞在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的研究进展

邱小锋(综述)　朱　荣 (审校)

(复旦大学基础医学院病理学系　上海　200032)



肿瘤干细胞在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的研究进展

邱小锋(综述)朱荣△(审校)

(复旦大学基础医学院病理学系上海200032)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种很常见的恶性肿瘤,流行病学和临床病理学研究发现其多发生在肝脏原有病变的基础上。在中国,长期慢性的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC发生的主要危险因子。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)理论认为HCC的起始细胞(tumor initial cell,TIC)是CSC,但其中的机制尚不明确,特别是CSC在HBV相关HCC 发生和发展中的作用。本文就肿瘤干细胞在HBV相关HCC发病中的机制及CSC标志物在临床诊疗和预后评估等方面的最新研究进展作一总结。

肿瘤干细胞;肝细胞癌;乙型肝炎病毒

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。2012年的统计数据显示[1],全球肝癌发病率和肿瘤相关死亡率分别位列恶性肿瘤的第6位和第2位。在全球每年约782 500例新增肝癌病例及745 500例肝癌相关性死亡病例中,中国占据半数左右。从病理组织类型来看,绝大多数的肝癌为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。许多流行病学和临床病理学的研究表明,诱导HCC发生的因素很多,包括嗜肝病毒感染、黄曲霉毒素等。由于HCC的病因不同,其临床特点、治疗手段和预后也有很大差异。而在我国,长期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC发生的主要危险因子之一。有数据表明在我国HBV流行区,80%～90%HCC患者均有感染HBV的慢性肝病史。HBV在HCC形成和发展中的作用,特别是其分子机制,是多年来研究的热点。

传统肿瘤理论认为肿瘤细胞来源于正常组织细胞的“去分化”(dedifferentiation),尽管肿瘤细胞具有异质性,但每个肿瘤细胞分裂的子代细胞都具有形成相同肿瘤的能力。然而,传统理论并不能很好地解释临床中HCC高转移性、术后的高复发性以及抗肿瘤化疗药物耐药性等现象。新的肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)理论则认为肿瘤中存在少量具有无限增殖、自我复制和分化潜能的CSC,数量上占绝对少数的CSC决定了肿瘤的演进,故又称肿瘤起始细胞(tumor initial cell,TIC)。越来越多的研究表明CSC在HCC形成、转移及术后复发中起到重要作用,尽管这其中有关HBV相关HCC的报道有限,但仍然为HBV相关HCC的基础研究和临床诊疗提供了新的方向和路径。

HBV相关HCC中常见的CSC标志物及其在组织和细胞中的表达目前常见的与HBV感染相关的特异性CSC标志物主要有EpCAM、CD133、CD90等。借助细胞免疫化学、流式细胞分选技术等可以寻找到HCC组织细胞上异常表达的标志物,通过临床样本分析和基础研究确定潜在的CSC,为判断预后和靶向治疗的研究提供新的目标。

上皮细胞黏附分子上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一种跨膜糖蛋白,可表达于肝干细胞和肝祖细胞的表面。EpCAM与细胞间的黏附作用相关,在上皮细胞癌变过程中发挥重要作用。Kimura等[2]研究发现,较丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相关HCC或其他病因相关HCC,HBV相关HCC的癌组织中EpCAM表达量显著增高。在EpCAM高表达水平组(EpCAM表达量>50%)中,患者血清AFP水平明显增高。在HBV相关HCC发生过程中,EpCAM表达水平的变化可反映HBV慢性感染的疾病进程;高表达水平的EpCAM同时提示预后不良。EpCAM在监测慢性乙型肝炎患者HCC的发生,治疗过程中肿瘤的耐药性、复发与转移等方面具有潜在的研究价值。

CD133CD133属于人细胞膜蛋白超家族成员,结构与动物实验模型中prominin-1蛋白质相似。CD133被证明表达于多种CSC表面,同时具有在分化细胞中表达下调的特征,因此成为常见的CSC标志物。Yin等[3]报道CD133阳性细胞存在于HCC细胞株与HCC患者肝癌组织中,具有TIC的部分特性,如集落形成能力、在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤的能力等,因而可将CD133作为HCC潜在的CSC标志物。Chan等[4]证实HCC病例中CD133能够独立反映HCC预后水平,在早期HCC的病例中(TNM分期Ⅰ期),CD133阳性患者整体存活期与无病生存期较阴性群体明显缩短。而在HBV相关HCC病例中,CD133表达水平的改变与HBV在肿瘤发生、进展中的行为相关。对于HBV相关HCC患者,监测其肝癌组织中的CD133表达水平同样有助于评估治疗方案和预后水平。

CD90CD90/Thy1是一种糖蛋白,锚定于糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)羧基端,参与细胞-细胞或细胞-基质间相互作用。CD90在人T细胞、胸腺细胞、神经元和内皮细胞上广泛表达,因此其在HBV相关HCC的检测中特异性不高,单因素检测不能确认肝癌组织中CD90阳性细胞为潜在的CSC,故CD90往往和其他干细胞标志物联合使用。Yang等[5]认为筛选CD45阴性CD90阳性表型细胞群有助于从肝癌组织中分离出CSC,并且CD90表达量与HBV感染因素相关。Lu等[6]研究临床HCC样本发现,CD90高表达与HBV感染以及HCC组织病理学分级相关,同时反映预后不良。HBV感染使HCC癌组织CD90表达量上升的机制仍不明确,可能为HBV病毒转录复制过程中CD90表达量增高,或者HBV感染诱导CD90阳性干细胞形成肝癌。总之,对于CD90与HBV相关HCC中CSC的关系,还需做进一步的临床分析和分子机制的研究,以明确其免疫分型的意义。

多种CSC标志物的共表达研究发现CSC往往存在标志物共表达的现象,即来源相同的CSC可能同时表达多种标志物,并且这些标志物的表达在特定情况下存在关联性。Chen等[7]研究发现CD133阳性EpCAM阳性的Huh7亚群细胞具有更强的富集能力、分化潜能、集落形成能力、化疗药物耐药性、成瘤能力和小鼠致瘤性等特征。因而,CD133与EpCAM共表达可用于筛选HBV相关HCC组织中潜在的CSC、分析其耐药性及作为临床药物作用的分子靶点。这一表型的CSC在HBV相关HCC中不具有普遍性,提示该表型与恶性潜能和恶性程度高度相关。Yamashita等[8]发现CD90与EpCAM在肝癌中相互独立表达,EpCAM阳性CSC具有上皮细胞特征,而CD90阳性细胞具有血管内皮细胞特征。在体外共表达时,CD90能够通过激活TGF-β信号通路增强EpCAM阳性细胞迁移能力,使得CD90和EpCAM双阳性细胞表现出较高的侵袭能力,两者的共表达提示预后更差。Liu等[9]检测了2 897例临床HCC样本中EpCAM、CD133、CD90、CD44等CSC标志物,发现这些标志物表达水平与肿瘤分期、HBV感染、AFP水平等因素相关。但在处于不同病程阶段的HCC活检样本中,各种CSC标志物单独表达,难以寻找到临床有效的CSC标志物;而综合检测分析EpCAM、CD133、CD90、CD44等共同表达水平,将有助于寻找更为合适的CSC表型。对于CSC标志物表达的多因素分析,有助于弥补单因素分析HBV相关HCC的不足。

HBV相关HCC中CSC的来源CSC理论认为CSC具有自我复制、分化潜能以及较强的耐药性等特点。Liu等[10]认为,在HBV相关HCC中,CSC并无明确的来源,可源于造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)或间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),前者表面标志物为CD133,而后者表面标志物为CD90或CD44,两者均可分化为多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)。PSC可分化为肝前体细胞/卵圆细胞,并在前体细胞表达OV6、EpCAM。PSC及肝前体细胞因“成熟受阻(maturation arrest)”机制可诱变为CSC,导致肝癌发生(hepatocarcinogenesis)。

Yeh等[11]也发现,HBV相关HCC肝癌组织样本中,CD133表达水平与HBsAg表达水平呈负相关,提示CSC更可能来源于“成熟受阻”的肝干细胞,而非感染病毒后“去分化”的肝细胞。因此,在HBV相关HCC临床样本中,能够检测到多种CSC标志物。对CSC标志物表达水平进行动态分析,有助于阐明肝癌发生过程中CSC生物学特性的变化,并能够解释标志物表达水平改变的临床意义。

HBV相关HCC中CSC的抗凋亡途径和耐药机制在HBV相关HCC中,CSC抗凋亡途径往往与肝干细胞发育相关的细胞信号转导通路相关。编码EpCAM的基因存在于Wnt/β-catenin通路中,调控肝干细胞的增生。Arzumanyan等[12]研究发现,HBV产生的HBx蛋白质能够激活β-catenin信号通路并上调miR-181的表达,这两者最终均能增加EpCAM的表达。Shen等[13]研究发现HBx具有稳定β-catenin的作用,从而激活Wnt/β-catenin通路,抑制CSC凋亡。Studach等[14]发现在HBV相关HCC发生过程中,SUZ12/PRC2的负向调节基因明显活化,SUZ12的表达下调,使得EpCAM表达水平显著升高。Fan 等[15]则进一步阐明了HBV相关HCC中HBx依赖的RelA半位点位于EpCAM转录起始位点(transcriptional start site,TSS)下游的CpG岛上。HBV复制导致NF-κB/RelA侧翼CpG中二核苷酸去甲基化,EpCAM的基因沉默机制受到抑制,从而介导EpCAM的表达。NF-κB的激活同时能够增加感染HBV细胞免疫逃逸的机会。HBV感染还能异常激活肝干细胞发育相关的信号通路,伴随此过程中多种产物的异常表达,CSC的抗凋亡作用增强。

CSC在体内或体外实验中均被证明存在耐药性,包括获得性耐药机制与固有耐药机制。获得性耐药指CSC在接受抗肿瘤药物刺激后,通过改变细胞信号转导通路而抑制凋亡的机制;而固有耐药机制指CSC对于部分抗肿瘤药物的天然不敏感现象。固有耐药机制与获得性耐药机制均可增强肿瘤干细胞的耐药性,并在肿瘤抵抗化疗药物、术后复发等方面发挥重要作用。两种耐药机制可以共同存在于CSC中,令临床治疗HBV相关HCC更为棘手。CD133分子亦被证明参与CSC耐药性机制。Ma等[16]发现CD133阳性肿瘤干细胞可优先激活Akt/PKB通路并表达Bcl-2抗凋亡蛋白。Akt/PKB位于多条细胞信号通路的交界点,能够调节多种生长因子的表达和Ras癌基因的活化,从而使得CD133阳性表型的CSC表现出恶性肿瘤转变的潜质。而Bcl-2抗凋亡蛋白的表达有助于CSC抵抗凋亡,逃避抗肿瘤药物治疗,获得耐药性,并在肝癌的复发中发挥重要作用。肝癌的耐药性亦可能来源于肝癌干细胞对化疗药物的主动外排机制。依据能将荧光底物Hoechst 33342泵出细胞外的特性,可从肝癌组织中分离出特定的侧群(side population,SP)细胞。临床上HCC活检发现SP细胞在癌组织中富集,对于部分抗肿瘤药物具有主动排出胞外的能力,从而对于化疗药物存在抵抗性。Jia等[17]在CD90阳性CD133阳性HBV相关HCC细胞株中发现Oct4和ABCG2显著高表达,Oct4被证明与干细胞自我更新与分化潜能相关[18],而ABCG2膜转运蛋白与肿瘤干细胞主动外排耐药性机制相关。

CSC与HBV相关HCC的分子靶向治疗分子靶向治疗旨在针对HCC内在异常存在的信号转导分子或产物蛋白,靶向攻击“非己”细胞,实施针对肿瘤细胞的打击,用以弥补目前临床治疗的缺陷。由于CSC存在耐药机制,致使HBV相关HCC对于多种化疗药物存在耐药性,而临床手术切除亦存在转移复发风险。常见的HCC分子靶向药物包括酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体等。索拉菲尼是目前为数不多的运用较广泛的肝细胞癌靶向治疗药物,通过抑制多种重要激酶,直接抑制CSC的增殖;同时通过抑制血管新生间接抑制肿瘤干细胞的生长[19],从而具有多种抗肝癌效应,可应用于晚期HCC患者的治疗中。索拉菲尼对于HBV相关HCC尚无特异性改变的报道。治疗HBV相关HCC的单克隆抗体报道较少,源于内在的分子机制尚未完全阐明。卡妥索单抗(catumaxomab)是EpCAM及CD3抗体,可用于治疗进展期卵巢癌、恶性腹水等[20],鉴于其靶向针对EpCAM的能力,为治疗HBV相关HCC提供了新的研究思路。

结语CSC理论能够较好地解释HBV相关HCC的发生、转移和术后复发等诸多问题,并为临床诊断、预后评估和各种治疗提供新的靶位,CSC在HBV相关HCC的诊疗具有广阔的应用前景。然而,目前的研究仍存在诸多不足之处,比如对于CSC与HBV相关HCC的研究多停留在相关性分析层面,分子机制的研究相对缺乏;标志物的确定仍缺乏共识;有效抑制耐药性的途径尚未发现;潜在的分子靶向治疗位点的临床数据不足。越来越多的基础研究和临床实验正在进行中,新的研究进展将会逐步完善CSC理论,并为HBV相关HCC患者带来实质性益处。

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E-mail:zhurongss@fudan.edu.cn

Research progress on the association of cancer stem cells with HBV-related hepatocellular carcinoma

QIU Xiao-feng, ZHU Rong△

(Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China)

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors worldwide.Epidemiological and clinicopathological analyses indicated that HCC mostly occurred on previous liver diseases,of which chronic infection of hepatitis B virus (HBV) was the main risk factor in China.The cancer stem cell (CSC) theory believed that CSCs were tumor initial cells (TICs) of HCC.So far,the association of CSCs with HBV-related HCC,especially their roles in the development and progression of HCC,has not been illustrated clearly.This review focused on the recent progress in the mechanisms of CSCs in HBV-related hepatocarcinogenesis,as well as the biomarkers of CSCs in clinical diagnosis,treatment and prognosis analyses.

cancer stem cell;hepatocellular carcinoma;hepatitis B virus

R735.7

Bdoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.017

2015-10-21;编辑:段佳)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China for Talent Training (J1210041).

国家自然科学基金人才培养项目(J1210041)