奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养下最适共培养体系的建立

木合依扎·热很别克，邵伟，赵艳坤，余雄

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)



奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养下最适共培养体系的建立

木合依扎·热很别克，邵伟，赵艳坤，余雄

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

【目的】研究乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养促进细胞增殖作用的机制，提高奶山羊乳腺上皮增殖水平。【方法】采用分离培养的1月龄健康萨能奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞，分别设乳腺上皮细胞单纯培养组和不同比例的乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养组，培养24、48、72、96、120和168 h时观察各组细胞的生长状态并检测细胞增殖率和贴壁率。【结果】混合培养组增值率和贴壁率比单纯培养组高，且细胞扁平时间晚于单纯培养组，混合培养体系可促进BMEC的增殖，减缓细胞凋亡。当BMEC与BMSCs以2∶1的比例混合培养到96 h时细胞的增值率和贴壁率最高。【结论】奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞共培养体系能够减缓乳腺上皮细胞的凋亡，促进乳腺上皮细胞增殖，提高细胞贴壁率。最佳共培养浓度为2∶1，最佳作用时间为96 h。

乳腺上皮细胞；骨髓间充质干细胞；共培养；细胞因子

0 引 言

【研究意义】乳腺上皮细胞是一种特化的、具有合成和分泌乳汁功能的细胞。体外培养的乳腺上皮细胞不但具有一定的泌乳功能[1-2]，而且能真实地反映乳腺生长发育及泌乳的细胞或分子生物学机制[3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有易分离纯化和体外扩增，研究表明其可分泌多种细胞因子[4]。共培养体系是为了模拟组织之间的相互作用，将多种细胞置于同一环境中，用以研究这些细胞之间复杂的相互反应[5]，所以该体系比单一细胞培养更能够准确地反映整体情况。【前人研究进展】由于乳腺细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳过程的两个重要方面。王立文[6]发现UC-BMSCs共培养能够促进BMEC的增殖。陈秋月[7]通过BMSCs与DPCs共培养可以在不减弱成牙能力的基础上显著提高细胞增殖力。【本研究切入点】试验将乳腺上皮细胞(BMEC)单纯培养和乳腺上皮细胞(BMEC)与不同比例的骨髓间充质干细胞(BMSCs)混合培养，在不同的时间段观察细胞的生长状态及形状，用MTT方法检测细胞增值率，细胞计数检测细胞贴壁率。【拟解决的关键问题】检测乳腺上皮细胞单纯培养与混合培养对乳腺上皮细胞的增殖及分化的影响，研究奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养最佳培养体系，为乳腺上皮细胞的培养提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 主要仪器

二氧化碳培养箱、倒置显微镜、低速离心仪、Benchmark酶标仪、六孔板。

1.1.2 主要试剂

高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25胰蛋白酶+EDTA、0.01%PBS、MTT检测试剂盒。

1.1.3 细胞制备

1月龄健康萨能奶山羊的乳腺组织中分离乳腺上皮细胞(BMEC)和骨髓中提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)，将乳腺上皮细胞(BMEC)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)经3代纯化培养。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将奶山羊的乳腺组织中分离乳腺上皮细胞和骨髓中提取骨髓间充质干细胞经3代培养纯化后设乳腺上皮细胞单纯培养组和不同比例的乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养组，分别按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1等不同比例接种于六孔板中培养，细胞总数维持在1×105/孔，单纯BMEC和单纯BMSCs对照组每皿接种1×105个细胞，保持接种细胞密度相同。37°、5%CO2孵育箱连续培养7 d，每天换液并收集各组上清保存于-80C°冰箱以便进一步检测。

1.2.2 骨髓间充质干细胞的分离与纯化

参考解放军兰州军区兰州总医院全骨髓法制备大鼠骨髓间充质干细胞方法，无菌采集1月龄雌性萨能奶山羊股骨，剔除肌肉、筋膜、骨膜、软骨等，用吸有培养液的一次性注射器冲出骨髓。采用percoll密度梯度离心法纯化细胞[8-9]。将分离纯化的细胞培养至P3代。

1.2.3 乳腺上皮细胞的分离、纯化

参考李庆章等[]的乳腺上皮细胞分离、纯化及传代方法，培养纯化至P3代。

1.2.4 乳腺上皮细胞(BMEC)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)混合培养

将培养至P3代生长状态良好的BMEC和BMSCs混合培养，10%FBS、5%CO2、37℃下培养，每48 h换液一次。

1.2.5 测定指标

形态学观察细胞的形状及生长状况、MTT法检测细胞增殖、用细胞计数法计算细胞贴壁率。

1.3 数据统计

计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间差异采用t检验，SPSS 16.0软件进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 BMEC单纯培养组与BMSCs混合培养组细胞形态变化检测

2.1.1 BMEC单纯培养组形态学观察

研究表明，P3代BMEC主要为呈多角形和卵圆形的上皮样细胞，在培养24～48 h时乳腺上皮细胞生长迅速、排列紧密、连接成片、轮廓清晰、细胞核呈圆形或椭圆形；96 h时细胞形状成类似圆顶状的结构；120 h时大部分细胞均可贴壁，呈现明显的生长晕，形成岛屿状的闭合型细胞生长群，并逐渐汇合成以鹅卵石或铺路石样为主的上皮细胞，间有少量的成纤维样细胞。图1

2.1.2 BMSCs单纯培养组形态学观察

P3代BMSCs培养24 h换液后，即可观察到贴壁细胞，细胞形态短小，呈长梭型、纺锤形；培养至96 h细胞明显增多、变长、变大、长梭型、纺锤形形态更加明显；120 h时，细胞基本铺满皿壁，细胞排列呈螺旋状或漩涡状。但细胞开始出现扁平化，部分细胞开始凋亡。

2.1.3 BMEC与BMSCs混合培养组形态学观察

倒式显微镜下观察共培养体系发现BMEC与BMSCs混合培养后两种细胞共同生长，24 h时较多细胞贴壁，BMEC呈圆形和多角形，大小不一；BMSCs呈长梭型和纺锤形。48 h时细胞明显增多，BMEC呈类似圆顶状，BMSCs呈长棱型或纺锤形。当96 h时BMEC呈鹅卵石或铺路石样；BMSCs呈长棱型或螺旋状。各组细胞生长状态均达到最佳，到168 h时细胞开始呈扁平状，收缩、体积变小。在同一时间不同比例条件下BMEC与BMSCs混合培养的形态跟两种细胞单纯培养下的形态无太大区别，但以2∶1的比例时细胞的生长状态最好并BMEC与BMSCs的形态跟原有的形态更相似。混合培养组的细胞在每个时间段形成的形状比单纯培养组的早一个时间点。

注：A1-A8分别为BMEC和BMSCs浓度比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培养组，右侧2张为BMEC单纯培养组与BMSCs单纯培养组

图1 BMEC的单纯培养组与BMSCs混合培养组细胞形态变化
Fig.1 BMEC simple culture group and BMSCs group mixed culture cell morphology change map

2.2 MTT检测细胞增殖结果

研究表明，将BMEC和BMSCs按照不同浓度比混合培养后，BMEC与BMSCs以2∶1的比例培养组的OD值最高，也高于单纯培养组，50∶1与100∶1的比例组OD值低于其他浓度组；2∶1浓度混合培养组在各时间段的OD值相比BMEC单纯培养组的增值率分别为40.74%、45.16%、46.34%、43.58%、37.14%、35.48%。从24 h时开始各组的OD值慢慢升高，到96 h时各组OD值均高于其他各时间段，从120 h时开始出现下降状态。表1

表1 不同浓度BMEC和BMSCs混合共培养后在不同时间点的OD值
Table 1 The OD values of the co-culture at different time(490 nm)

分组Group24h48h72h96h120h168hA10.350.410.430.530.410.33A20.380.450.560.60.480.42A30.330.420.460.510.440.31A40.310.40.440.480.440.32A50.330.410.40.420.40.28A60.30.380.380.410.410.26A70.280.360.350.370.330.27A80.250.330.320.370.30.23BMSCs0.230.320.310.390.340.2BMEC0.270.310.390.410.350.31增值率(%)40.7445.1643.5846.3437.1435.48

注：A1-A8分别为BMEC和BMSCs浓度比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培养组；增殖率表示2∶1浓度组与BMEC单纯培养组相比的增殖率

2.3 细胞贴壁率检测

研究表明，将BMEC和BMSCs按照不同浓度比混合共培养后，各组细胞贴壁率均随时间的增加而增加，其中2∶1浓度组细胞贴壁率最高，但与其余各组之间差异不显著；BMEC与BMSCs单纯培养组24 h时开始贴壁，而混合培养组在24 h时部分细胞已贴壁，当96 h时混合培养组1∶1、2∶1、3∶1比例组的细胞贴壁率已超过80%，而BMEC与BMSCs单纯培养组的贴壁率分别为78%和75%。当96 h时各组细胞贴壁率达到高峰，从120 h开始慢慢下降。图2

注：A1-A8分别为BMEC和BMSCs浓度比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培养组。

图2 不同浓度BMEC和BMSCs混合共培养后在不同时间点的各组细胞贴壁率
Fig.2 The cells adherent rate of the co-culture at different time

3 讨 论

3.1 BMEC与BMSCs共培养对BMEC细胞形态变化的影响

试验将奶山羊乳腺上皮细胞(BMEC)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)单纯培养和混合培养下进行形态学观察，发现当混合培养24 h时BMEC呈圆形和多角形，与乳腺上皮细胞单纯培养48 h的形态更接近，混合培养96 h时BMEC呈鹅卵石或铺路石样，各组细胞生长状态均达到最佳，与BMEC单纯培养组120 h的形态所接近，从而推测为共培养加快了乳腺上皮细胞的生长、增殖。这是因为骨髓间充质干细胞是一类具有自我复制、多向分化潜能的干细胞，既容易分离又易于在体外扩增，它通过旁分泌功能可分泌各种可溶性细胞因子，从而为乳腺上皮细胞的生长和增殖提供必要的微环境，所以这些细胞因子调控了乳腺上皮细胞的增殖并提前了乳腺上皮细胞的增殖时间。

当BMEC与BMSCs混合培养到168 h时细胞开始缩小、呈扁平状，而单纯培养组在120 h后开始呈现扁平化，说明混合培养组细胞衰老时间晚于单纯培养组。骨髓间充质干细胞通过分泌的细胞因子激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，调控BMEC的细胞周期[10]，所以混合培养组中BMSCs可以分泌多种细胞细胞因子，这些细胞因子激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路，调控BMECs的细胞周期，从而延缓了细胞的凋亡，细胞变形时间推迟。

在混合培养体系下比较不同浓度组的细胞生长状态发现BMSCs浓度越高细胞的生长状态越好，与两种细胞本身的形态越接近，其中BMEC与BMSCs按2∶1的浓度混合培养组细胞形态最佳。施晓雷等[11]在猪肝细胞与骨髓间充质干细胞最适共培养体系的建立中证实肝细胞与MSCs以2∶1的比例混合培养组的增殖能力最强。其与试验结果相符，所以BMEC与BMSCs以2∶1的浓度混合培养更适合BMEC的增殖。

3.2 BMEC与BMSCs共培养对BMEC细胞增值率的影响

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，MTT值的高低表示细胞的活性。试验用MTT法检测细胞的增殖，结果显示BMEC与BMSCs按2∶1浓度混合培养96 h时的增值率最高，96 h时2∶1浓度混合培养组的OD值比BMEC单纯培养组的增值率高46.34%，其次是72 h和120 h的增值率较高；在不同比例的混合培养组各个时间段的增值率几乎都高于单纯培养组。

李全修等[12]用骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养，发现骨髓间充质干细胞能显著增加髓核细胞增殖，故试验BMSCs与BMEC混合培养中BMSCs通过自身分泌和旁分泌功能分泌大量的细胞因子，从而调控了BMEC的增殖，使混合培养组细胞的活性更加旺盛。Sneddon等[13]证实使用适当的培养系统、选择匹配的组织来源的干细胞可以提高胚胎干细胞增殖和自我更新的能力，所以共培养体系可影响干细胞多向分化能力和增值能力。

3.3 BMEC与BMSCs共培养对BMEC细胞贴壁率的影响

将BMEC和BMSCs按照不同浓度比混合共培养后，各组细胞贴壁率均随时间的增加而增加，其中2∶1浓度组细胞贴壁率最高。当96 h时各组细胞贴壁率达到高峰，从120 h开始慢慢下降。这是细胞在进行传代培养后，细胞外层角质开始延伸，贴紧细胞瓶生长，而角质的生长受到细胞自身活性、培养体系营养水平和生长因子的影响。在此次试验中各组细胞培养体系营养水平相同，但共培养组骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子，提高了细胞活性，促进了角质的增长，提高细胞的贴壁。

有关乳腺上皮细胞的研究较多，但乳腺上皮细胞与干细胞共培养的研究较少，王立文等[]在奶牛乳腺上皮细胞与脐带间充质干细胞共培养试验中证实奶牛脐带间充质干细胞与乳腺上皮细胞按1∶2的比例培养72 h时共培养体系细胞的增殖最佳；顾劲扬在骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养研究试验中提出肝细胞与骨髓间充质干细胞2∶1组成的最适共培养体系培养至第2 d时有望为今后BAL的构建提供理想细胞材料；试验与其不同是奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞以2∶1的比例混合培养96 h时增殖最佳。原因是不同动物的细胞生长情况不相同，所以推测为奶山羊的乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞的增殖比奶牛的乳腺上皮细胞与脐带间充质干细胞的增殖慢些。

4 结 论

奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞共培养体系能够减缓乳腺上皮细胞的凋亡，促进乳腺上皮细胞增殖，提高细胞贴壁率。最佳共培养浓度比值为2∶1，最佳作用时间为96 h；2∶1浓度混合培养组在24、48、72、96、120和168 h的OD值相比BMEC单纯培养组的增值率分别为40.74%、45.16%、46.34%、43.58%、37.14%、35.48%，其中96 h时的OD值比例最高，增殖为46.34%。

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Fund project:Xinjiang Key Laboratory topics(2015KL018)；China Postdoctoral Foundation；2015 National Natural Science Foundation(31560645) ；Xinjiang College Research Program(XJEDU2013S17)；"Twelve Five" National Science and Technology Support Project(2012BAD12B09)；Ministry of Agriculture, the modern dairy industry technology system (Cars-37) funding.

Establishment of the Optimal Co-culture System of Dairy Goat Mammary Epithelial Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Mixed Culture

Muheyizha Rehenbieke, SHAO Wei, ZHAO Yan-kun,YU Xiong

(CollegeofAnimalSciences,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 To explore the effects of mammary epithelial cells co-cultured with mesenchymal stem cells on cell proliferation.【Method】1-month-old Saanen dairy goat mammary epithelial cell and bone marrow mesenchymal stem cells were used and mammary epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells mixed culture group were set up respectively in the simple culture group along with different proportions of mammary epithelial cells. After they were cultured 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 168 h, the growth state of the cells was observed and the cell proliferation rate and adherence rate were detected.【Result】The results showed that appreciation and attachment rate of mixed culture group were higher than those of the simple culture group, and cell flat time was later than pure culture group．Mixed culture system could promote the proliferation of BMEC and slow apoptosis．When the ratio of BMEC and BMSCs was mixed in the proportion of 2∶1 to 96 h, the rate of increment and adherence rate of the cells was the highest.【Conclusion】The co-culture system of dairy goat mammary epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells can slow down the apoptosis of mammary epithelial cells, promote breast epithelial cell proliferation，and increase cell adhesion rate．The best co-culture concentration is 2∶1，and the time is 96 h.

mammary epithelial cells；mesenchymal stem cells；co-culture；cytokine

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.024

2016-06-07

新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(2015KL018)；中国博士后基金委；国家自然基金项目(31560645)；新疆维吾尔自治区高等学校科研计划项目(XJEDU2013S17)；“十二五”国家科技支撑项目(2012BAD12B09)；农业部现代奶业产业技术体系(Cars-37)

木合依扎·热很别克(1991-)，女，新疆沙湾人，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料学，(E-mail)1437976787@qq.com

余雄(1958-)，教授，博士生导师，中国奶产业体系科学家，研究方向为动物营养与饲料，(E-mail)yuxiong8763601@126.com

文献标识码：A 文章编号：1001-4330(2016)11-1954-07