新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

郭开发，姚兆群，吴彩兰，向本春，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003)



新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

郭开发，姚兆群，吴彩兰，向本春，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003)

【目的】建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法，为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据。【方法】针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsamali)，污黑腐皮壳(Valsa.sordida)，Leucostomaniveum和Valsa.malicola的rDNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物。【结果】属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带，检测灵敏度为10 pg/mL；设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的条带，检测灵敏度均为10 pg/mL。【结论】采用腐烂病菌Valsa 的rDNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法，可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测。

林木；腐烂病菌；rDNA-ITS；PCR检测；特异性引物

0 引 言

【研究意义】新疆具有发展特色林果产业的地理气候优势，截止到2014年底，特色林果种植面积已达167.67×104hm2，总产量650×104t，产值450×108多元，新疆已成为全国重要的“西域大果园”[1]。然而新疆冬季寒冷，林木受冻后易发生腐烂病，尤其近年来香梨优斑螟在新疆南疆苹果、梨、枣、杨树等林木上普遍发生，进一步加重了腐烂病为害[2,3]。由于腐烂病菌具有潜伏侵染特性，树木受感染后早期不表现症状，待树势衰弱后开始扩展并导致腐烂病发生，此时防治为时已晚[4]。若能在果园枯枝落叶以及树皮上提前检测到腐烂病菌的存在，并在其蔓延扩散前进行预防，可有效提高林木腐烂病的防治效果。【前人研究进展】Zang[5]依据腐烂病菌rDNA-ITS的特异序列，设计3种特异性引物分别检测三种苹果树腐烂病菌V.malivar.mali，V.malicola，V.persoonii，检测灵敏度达到100 fg/μL。【本研究切入点】腐烂病的检测采用传统分离方法费时费力，且对潜伏侵染部位以及新感染部位分离效果不佳，基于腐烂病菌 rDNA-ITS 序列分析的PCR检测技术则更为有效和准确[5]。研究采用林木腐烂病菌的rDNA-ITS 序列设计特异性引物，为林木腐烂病菌的快速检测提供技术支持。【拟解决的关键问题】以林木腐烂病在新疆已报道种Valsamali,Valsasordida,Leucostomaniveum和Valsamalicola[2]为研究对象，设计特异性引物，建立针对新疆林木腐烂病菌快速、准确的PCR 检测方法，为新疆林木腐烂病菌的早期监测和防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用腐烂病菌菌株有4个种，分别是V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola，前期已通过形态学、ITS序列、β微观蛋白基因等进行准确鉴定。列出菌株编号、来源、种名以寄主等。表1

表1 腐烂病菌分子快速检测供试菌株
Table 1 The strains of valsa canker pathogens were used to rapid molecular detection

序号No.编号IsolatesNo.来源Originsofstrains种名Species寄主Host16T4L-L新疆兵团第一师6团Regiment6ofDivisionNo.1ofXPCG,Akesu,XinjiangV.mali梨树Pyrus229-1-6新疆兵团第二师29团Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.mali梨树Pyrus328-Y-1-1新疆兵团第二师28团Regiment28ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.mali毛白杨Populustomentosa4cfcc84640中国林业微生物菌种保藏管理中心ChinaforestryculturecollectioncenterV.mali海棠Malusspectabilis5TMG-3新疆兵团第二师29团Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.sordida胡杨Populuseuphratica6Ks新疆喀什市Kashgar,XinjiangV.sordida毛白杨Populustomentosa7HS-2新疆巴州和硕县HeshuocountyofXinjiangV.sordida沙枣Elaeagnusangustifolia8cfcc85445中国林业微生物菌种保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.sordida毛白杨Populustomentosa9cfcc84642中国林业微生物菌种保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.sordida刺槐Robiniapseudoacacia1022T-XL新疆兵团第二师22团Regiment22ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.malicola梨树Pyrus1129-1-11新疆兵团第二师29团Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.malicola梨树Pyrus12TMG-8新疆兵团第二师29团Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,KorlaXinjiangL.niveum新疆杨Populusalba13YQ-1新疆巴州焉耆县YanqicountyofXinjiangL.niveum新疆杨Populusalba14cfcc86482中国林业微生物菌种保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.mali苹果Malus15FCH-1新疆兵团第六师芳草湖农场FangcaohufarmofDivisionNo.6ofXPCG,Changji,XinjiangAlternariasp.毛白杨Populustomentosa16FCH-2新疆兵团第六师芳草湖农场FangcaohufarmofDivisionNo.6ofXPCG,Changji,XinjiangFusariumsp.毛白杨Populustomentosa

注：黑色字体为购买的标准菌株; XPCG为新疆生产建设兵团(Xinjiang Production and Construction Group)简写

Note:Standard strains are presented with black font;XPCG are short for Xinjiang Production and Construction Group

1.2 方 法

1.2.1 特异性引物设计

采用 DNAStar 软件中的 Seqman 程序，对V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola的rDNA-ITS 序列和在 GeneBank 中找到的同属其它种的 rDNA-ITS 序列进行多重同源性比较，以这四个种的 rDNA-ITS保守区段和多态性丰富的特异性区段为靶标，参考藏睿等[6]文献报道的Valsa属专化型引物VF/VR，应用Primer 5.0 软件分别设计种特异性引物(Species-specific primers)，其中针对V.mali的是VmmF/VmmR，目标片段263 bp，针对V.sordida的是VsF/ VsR，目标片段423 bp，针对L.niveum的是VnF/ VnR，目标片段307 bp，以及针对V.malicola的是VmF/VmR，目标片段308 bp。引物委托北京华诺时代科技有限公司合成。表2

表2 林木腐烂病的保守引物和种特异性引物的序列与退火温度
Table 2 The nucleotide sequences and annealing temperatures of universal primers and species-specific primers of tree Valsa canker

引物名称(Primername)引物序列PrimerSequence(5’-3’)引物退火温度Annealingtemperature(℃)VmmFGCCGGCGGCCCAATTAA52VmmRCGCCCGGAGGCGGTCTC59VsFTCGTAAAACACCTGGGGAAAA50VsRAAATTTTCAGAAGTTGGGGGT49VnFCTGGTCGTCAAAAGCCAGGGGA59VnRTTCTGTAAACAGTCAGGTAATGCCCC58VmFTTGGCTGCCTCTCCCCTCGG60VmRGGAAGGTAATGCCCCAACACC56VFGTTGCCTCGGCGCTGGCT57VRGCGAGGGTTTTACTACTGC51

1.2.2 DNA提取及PCR反应

病原菌DNA的提取采用Edwards[7]的方法：挑取少量腐烂病菌菌丝体加入1.5 mL离心管中，加入500 μL的buffer提取液(200 mM Tris HCl pH 7.5，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% SDS)，用研磨棒进行研磨，室温静置2 h，13 000 r/min离心2 min，取上清液400 μL加入新的离心管中；加入400 μL的异丙醇，静置5 min后，13 000 r/min离心5 min后，弃上清液；加入75%乙醇进行洗涤，晾干后加入40 μL的TE溶液，-20℃保存。也可采用市售DNA提取试剂盒提取病原菌的DNA。

PCR反应体系：PCRTaqMix 10 μL，10 μmol/L引物各1 μL，病原物DNA 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL，终体积为25 μL。扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30s，引物退火30s，72℃延伸40s，30个循环；最后72℃延伸10 min。反应完成后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。表2

1.2.3 引物特异性检测

以在林木腐烂病菌分离过程中出现频率最高的其它属分离物：1株链格孢菌(Alternariasp.)和1株镰刀菌(Fusariumsp.)为阴性对照。用合成引物对参试菌株的基因组DNA 进行PCR扩增，检测其特异性条带的有无来分析引物的特异性。

1.2.4 引物灵敏度检测

用紫外分光光度计测量所提取腐烂病菌基因组DNA 的OD260值，将浓度调整为1 μg/mL，并按10倍梯度稀释为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL备用。PCR反应体系和反应程序同上。

“学为中心”要求教师尽量减少对学生学习时间的占领，把学习的大部分时间交给学生，让学生自己“生发”知识。只有学生自已“生发”出来的浸润着学生自己血脉的知识才有生命，才是刻骨铭心的。

2 结果与分析

2.1 属专化性引物检测

属专化性引物的检测，旨在快速检测枯枝落叶以及树皮上是否携带腐烂病菌，而非腐烂病菌则不能扩增出特异性条带。研究表明，VF/VR引物对4个种均可以检测到约为350 bp的条带，而链格孢菌(Alternariasp.)和镰刀菌(Fusariumsp.)及对照均未检测到特异性条带。图1

注：泳道1～4为V.mali菌株；5～9为V.sordida菌株；10～11 为L.niveum菌株；12～13为V.malicola菌株；14为V.mali菌株；15～17分别为Alternariasp、Fusarium sp.和阴性对照；M表示2 000 DNA Marker，下同

Note:Lane 1-4 isV.mali, lane 5-9 isV.sordida, lane 10-11 isL.niveum, lane 12-13 isV.malicola,lane 14 isV.mali，line 15 to 17 isAlternariasp.,Fusariumsp.and CK (no DNA template), M represents 2,000 DNA Marker, the same as below

图1 属专化型引物VF/VR对不同病原物检测结果
Fig.1 Specificity test of genus-specific primers VF/VR by PCR from different strains

2.2 种特异性引物检测

对种特异性引物特异性的检测，检测所设计的引物是否只具有靶向的唯一性，即只对其所检测的靶标菌进行扩增，而不能对非靶标菌进行扩增。

研究表明，菌株6T4L-L，29-1-6，28-Y-1-1，cfcc84640和cfcc86482共5株为V.mali，仅6T4L-L，29-1-6，28-Y-1-1，cfcc84640检测到约为250 bp左右的目的片段，cfcc86482和其他菌株均未检测到目标片段。表明引物VmmF /VmmR对V.mali具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.mali的快速分子检测。图2

图2 VmmF/VmmR 对不同病原菌特异性检测
Fig.2 Specificity test of species-specific primersVmmF/VmmR by PCR from different isolates

研究表明，采用特异性引物对TMG-3，KS，HS-2，cfcc84642和cfcc95445共5株均为V.sordida菌株，可以检测到约为400 bp左右的目的片段，其他腐烂病菌、镰刀菌和链格孢属均未检测到特异性目标条带。表明引物VsF /VsR对V.sordida具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.sordida的快速分子检测。图3

图3 VsF/VsR 对不同病原菌特异性检测
Fig.3 Specificity test of species-specific primersVsF/VsR by PCR from different isolates

研究表明，22T-xl和29-1-11共2株均为L.niveum，通过PCR检测均扩增出约为300 bp左右的目的片段，而其他的均未检测到。说明引物VnF/VnR对L.niveum具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.nivea的快速分子检测。图4

研究表明，TGM-8、YQ-1共2株为V.malicola，通过检测到约为300 bp左右的目的片段，其他的均未检测到。表明引物VmF /VmR对V.malicola具有相对专一性，可用于腐烂病菌V.malicola的分子检测。图5

图4 VnF/VnR 对不同病原菌特异性检测
Fig.4 Specificity test of species-specific primersVnF/VnR by PCR from different isolates

图5 VmF/VmR 对不同病原菌特异性检测
Fig.5 Specificity test of species-specific primersVmF/VmR by PCR from different isolates

以稀释为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL作为模板，选用属专化型引物VF/VR进行PCR扩增后，均可以检测出一条400 bp左右的条带，条带较为清晰。图6

注：泳道1～6分别为稀释浓度为1 μg/mL，100 ng/mL，10 ng/mL，1 ng/mL，100 pg/mL，10 pg/mL，泳道7为对照，M表示2 000 DNA Marker

Note:Lanes 1-6：Amplified products using DNA at concentrations of 1 μg/mL,100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL,100 pg/mL, 10 pg/mL，respectively, lane 7 for control, M represents 2,000 DNA Marker.

图6 属专化型引物对腐烂病菌灵敏性检测
Fig.6 Sensitivity of PCR with specific primers for detection of Valsa Canker

4种腐烂病菌V.mali、V.sordida、L.niveum、V.malicolaDNA浓度稀释后，选择对应种特异性引物进行PCR 扩增后电泳条带。4种病原物DNA浓度稀释为10 pg/mL时均可以检测到条带。图7

注：泳道1～6分别为稀释浓度分别为1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL，泳道7为对照，M表示2 000 DNA Marker(A :V.mali; B:V.sordida; C: L.niveum; D:V.malicola)

Note:Lanes 1-6：Amplified products using DNA at concentrations of 1 μg/mL,100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL,100 pg/mL, 10 pg/mL respectively, lane 7 for control, M represents 2,000 DNA Marker

图7 种特异性引物对腐烂病菌灵敏性检测
Fig.7 Sensitivity of PCR with specific primers for detection of Valsa Canker

3 讨 论

随着分子检测技术的发展，建立基于 rDNA-ITS区段的分子检测技术已得到了广泛应用[8-10]。Feau[11]利用种特异性的引物，成功的从杨树上检测到了三种壳针孢属(Septoria)病原菌的存在。Zang[5]利用苹果树腐烂病菌的 rDNA-ITS 的特异区段为靶标设计特异性的引物，区分苹果树腐烂病菌V.malicola，V.persoonii和V.malivar.mali，检测灵敏度达到100 fg/μL。周晓云等[12]设计特异性引物SF1/SR2对华丽腐霉(A.andraeanum)进行快速检测，检测灵敏度在 DNA 水平上可达1 pg。

新疆林木腐烂病有逐年加重的趋势，已成为新疆林木主要的病害之一[13,14]。腐烂病菌危害寄主种类较多，且病菌种类复杂多样[15-18]。传统的生物学形态鉴定就显得十分困难。因此建立快速PCR检测技术对于腐烂病病害的早期诊断、预防显得十分重要。研究中采用的属专化型引物VF/VR能准确的区别出林木腐烂病菌和其他病菌，检测灵敏度达到10 pg/mL。设计的四对种特异性引物，可准确的区分四种林木腐烂病菌V.mali、V.sordida、L.niveum、V.malicola。检测浓度达到10 pg/mL。

研究建立方法只对新疆林木腐烂病进行快速定性检测，并且可满足农业生产上大量样品批量检测的需求。很多文献报道苹果腐烂病菌V.mali存在异名[19-21]。研究设计的VcF/VcR特异性引物中，购买的菌株V.mali(cfcc86482)没有被检测出来，具体原因还需要进一步试验进行确认。同时新疆林木腐烂病菌是否存在其他种类，也需要进一步进行分离鉴定。

4 结 论

建立了一种基于DNA分析的新疆林木腐烂病菌的PCR快速检分子测检测体系，该体系可以快速检测出枯枝落叶以及潜伏侵染的腐烂病菌，设计的属专化型引物对4种腐烂病菌均检测到424 bp的条带，检测灵敏度为10 pg/mL；设计的4对种特异性引物分别对4种腐烂病菌V.mali，V.sordida，L.niveum，V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的条带，检测灵敏度均为10 pg/mL。该方法具有高通量、快捷、灵敏度高的特点，用于新疆林木腐烂病预测预报、田间诊断，越冬场所、传播途径等研究有重要意义。

References)

[1]牛金辉. 新疆特色林果种植面积突破 2 200 万亩[N]. 新疆科技报(汉),2015-02-13(001)

NIU Jin-hui. (2015). Fruit cultivation area exceeded 146.67*104hm2in Xinjiang [N].XinjiangScienceandTechnology, 2015-2-13(001)

[2]杜琴,孔利,赵思峰,等.新疆库尔勒香梨腐烂病病原鉴定[J].新疆农业科学,2013,50(12):2 258-2 265.

DU Qin, KONG Li, ZHAO Si-feng, et al. (2013). Identification of valsa canker pathogen of Korla pear tree [J].XinjiangAgriculturalSciences, 50(12):2,258-2,265.(in Chinese)

[3]侯世星，温俊宝，庞华.新疆果树害虫香梨优斑螟研究进展[J].林业科学，2011,47(9)：148-152.

HOU Shi-xing, WEN Jun-bao, PANG Hua. (2011). Research Progress of Euzophera pyriella [J].ScientiaSilvaeSinicae, 47(9)：148-152.(in Chinese)

[4]宋娜，戴青青，黄丽丽，等.苹果树腐烂病菌 GTP-环化水解酶II 基因敲除载体构建及其突变体的表型分析[J].中国农业科学，2014，47(15):2 980-2 989.

SONG Na, DAI Qing-qing, HUANG Li-li, et al. (2014).Construction of Knockout Vector of GTP Cyclohydrolase II Gene and Mutant's Biological Characteristics of Valsa mali [J].ScientiaAgriculturaSinica，47(15):2,980-2,989.(in Chinese)

[5] Zang, R., Yin, Z., Ke, X., Wang, X., Li, Z., & Kang, Z., et al. (2012). A nested pcr assay for detecting valsa mali var. mali in different tissues of apple trees.PlantDisease, 96(11):1,645-1,652.

[6] 藏睿.中国苹果树腐烂病菌的种群组成、分子检测及其ISSR遗传分析[D].杨凌：西北农林科技大学博士学位论文,2011.

ZANG Rui. (2011).ThephylogenticrelationshipmoleculardetectionappletreevalsacankercausalagentsinChina,andpopulationstructureanalysisusingISSRmarker[D]. PhD Dissertation. Northwest A & F University. Yangling.(in Chinese)

[7] Edwards, K., Johnstone, C., & Thompson, C. (1991). A simple and rapid method for the preparation of plant genomic dna for pcr analysis.NucleicAcidsResearch, 19(6):1,349-1,349.

[8]赵永强,张成玲, 张薇, 等.烟草根黑腐病菌的PCR分子检测[J].植物病理学报,2009,39(1):23-29.

ZHAO Yong-qiang, ZHANG Chen-ling, ZHANG Wei, et al. (2009). Molecular detection ofThielaviopsisbasicolaby PCR assay [J].ActaPhytopathologicaSinica, 39(1):23-29.(in Chinese)

[9] 张海峰,任众, 刘翔, 等.冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)的快速分子检测[J].植物病理学报,2008,38(3):231-237.

ZHANG Hai-feng, REN Zhong, LIU Xiang, et al. (2008). Rapid molecular detection ofPhytophthorahibernalisby PCR [J].ActaPhytopathologicaSinica, 38(3):231-237. (in Chinese)

[10]宋娜,陈卫民,杨家荣，等.向日葵黑茎病菌的快速分子检测[J].菌物学报,2012,31(4):630-638.

SONG Na, CHEN Wei-ming, YANG Jia-rong, et al. (2012).Fast molecular detection of the pathogen of sunflower black stem [J].Mycosystema, 31(4):630-638. (in Chinese)

[11] Feau, N., Weiland, J. E., Stanosz, G. R., & Bernier, L. (2005). Specific and sensitive pcr-based detection of septoria musiva, s. populicola and s. populi the causes of leaf spot and stem canker on poplars.MycologicalResearch, 109(Pt 9):1,015-1,028.

[12]周晓云,游春平.红掌根腐病病原鉴定及其PCR检测方法[J].园艺学报,2013,40(5):989-996.

ZHOU Xiao-yun, YOU Chun-ping. (2013). Identification and PCR Detection of the Pathogen Causing Root Rot ofAnthuriumandraeanum[J].ActaHorticulturaeSinica, 40(5):989-996. (in Chinese)

[13] 潘朝印.库尔勒香梨树腐烂病大流行原因浅析及防治意见[J].植保技术与推广,1997,17(3):29.

PAN Chao-yin. (1997). Korla fragrant pear rot disease causes and prevention [J].PlantProtectionTechnologyandExtension，17(3):29. (in Chinese)

[14]郭铁群.库尔勒香梨病虫害发生趋势及综合治理研究[J].新疆农业科学,2002，39(1):27-30.

GUO Tie-qun. (2002). Occurrence trend and comprehensive control of pests and diseases of Korla fragrant pear[J]．XinjiangAgriculturalSciences，39(1):27-30． (in Chinese)

[15] Adams, G. C., Wingfield, M. J., Common, R., & Roux, H. (2004). Phylogenetic relationships and morphology of cytospora species and related teleomorphs ( ascomycota, diaporthales, valsaceae ) from eucalyptus.StudiesinMycology:52.

[16]马荣,王阳阳,刘晓琳,等.新疆核桃树腐烂病拮抗细菌的筛选及初步鉴定[J]. 新疆农业科学,2015,52(5):895-901.

MA Rong, WANG Yang-yang, LIU Xiao-lin, et al. (2015). Isolation and identification of the antagonistic bacteria against Walnut canker in Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(5):895-901. (in Chinese)

[17] 岳朝阳，张新平，马沛沛，等．新疆杨树不同种、品种(无性系)造林初期对腐烂病的抗性研究[J].西北林学院学报,2011,26(1):113-118．

YUE Zhao-yang, ZHANG Xin-ping, MA Pei-pei, et al. (2011). Resistance of different poplars in the initial afforestation stages onCytosporachrysospermain Xinjiang [J].JournalofNorthwestForestryUniversity, 26(1):113-118．(in Chinese)

[18] Zhuang, W. Y., Guo, L., Guo, S. Y., Guo, Y. L., Mao, X. L., & Sun, S. X., et al. (2005). Fungi of northwestern china. Fungi of Northwestern China.

[19] Kobayashi, T. (1970). Taxonomic studies of japanese diaporthaceae with special reference to their life-histories.JapForestExpStaBull.

[20] Suzaki, K. (2008). Population structure of valsa ceratosperma, causal fungus of valsa canker, in apple and pear orchards.JournalofGeneralPlantPathology, 74(2):128-132.

[21] Wang, X., & Kang, Z. (2011). Re-evaluation of pathogens causing valsa canker on apple in china.Mycologia, 103(2):317-324.

Fund project:The science and technology aid project of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(201491150); The project of the introduction of the higher-grade talented persons of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(2015-2017)

Rapid PCR Detection Technology for Four Species of Valsa Canker Pathogens of Trees in Xinjiang

GUO Kai-fa，YAO Zhao-qun，WU Cai-lan，XIANG Ben-chun，ZHAO Si-feng

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 To develop a rapid PCR assay for detection of trees Valsa canker in Xinjiang and provide the technical support for forecast and prevention of treesValsacanker.【Method】Based on rDNA-ITS conservative sequence of theValsagenus, a pair of genus-specific primers and four pairs of species-specific primers were designed forValsamali,Valsasordida,LeucostomaniveumandValsamalicola.【Result】Using genus-specific primers VF/VR to amplify a unique 424 pb band from Valsa and using four pairs of species-specific primers to amplify 263 bp,423 bp, 307 bp and 308 bp band fromV.mali,V.sordida,L.niveumandV.malicolarespectively. And the detection sensitivity was 10 pg/mL.【Conclusion】The results suggested that developed rapid molecular detection method in this study based on rDNA-ITS conservative sequence of theValsagenus can be used in the Xinjiang treesValsacanker.

tree;Valsacanker；rDNA-ITS；PCR detection；specificity primers

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.010

2016-12-30

新疆维吾尔自治区科技援疆项目(201491150)；新疆维吾尔自治区高层次人才引进项目(2015-2017)

郭开发(1985-)，男，甘肃威武人，博士研究生，研究方向为植物菌物病害，(E-mail)andygkf@126.com

向本春(1958-)，男，四川宣汉人，教授，博士生导师，研究方向为植物病理学，(E-mail)xbc@shzu.edu.cn 赵思峰(1975-)，男，四川巴中人，教授，博士生导师，研究方向为植物菌物病害及其生物防治，(E-mail)zhsf_agr@shzu. edu.cn

S436.6

A

1001-4330(2016)10-1843-07