辣蓼总黄酮超声波辅助提取条件优化研究

张 晶，黄士文，徐绍清，田 方，倪 穗*

(1.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211；2.慈溪市横河镇农业办公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市农业局，浙江 慈溪 315318；3.宁波市缸鸭狗健康食品与生物技术研究所，浙江 宁波 315205)



辣蓼总黄酮超声波辅助提取条件优化研究

张 晶1，黄士文2，徐绍清3，田 方4，倪 穗1*

(1.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211；2.慈溪市横河镇农业办公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市农业局，浙江 慈溪 315318；3.宁波市缸鸭狗健康食品与生物技术研究所，浙江 宁波 315205)

目的：优化超声波辅助法提取辣蓼黄酮类化合物的工艺条件。方法：实验从超声温度、料液比、乙醇浓度和超声时间四个方面对黄酮类化合物的提取效果进行了探讨，通过单因素试验确定提取黄酮类化合物的较优水平，再结合正交试验确定辣蓼全草中黄酮类化合物的最优提取工艺。结果和结论：经研究所得工艺的最佳参数为：乙醇浓度60%，料液比1∶45，超声温度50 ℃，提取时间50 min。在此工艺条件下得到黄酮类化合物含量为55.8 mg/g。由此证明辣蓼中黄酮类化合物能够利用超声波辅助法来方便有效地提取。

辣蓼；黄酮类化合物；超声波；提取工艺

辣蓼，又名水蓼(PolygonumhydropoperL.)，是蓼科(Polygonum)蓼属(PolygonumL.)一年生草本植物，直立或下部伏地，有须根，叶呈卵圆形或披针形，互生[1]。辣蓼主要分布在东南亚地区，生长在水边潮湿的地方[2]，在我国各地均有分布，而浙江全省分布的较为广泛，野生资源丰富。辣蓼全草味辛，中国及东南亚等许多国家已把辣蓼列入到食品添加剂中，它可以用来增加食物的风味。辣蓼还是我国传统的药材，许多古医书中对其药理功能都有过记载，具有化湿、行滞、祛风、消肿的功效[3]。临床研究发现，辣蓼有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抑肿瘤、镇痛止血等功效，黄酮类化合物是其主要的生物活性成分[4-6]。黄酮类化合物有强抗氧化活性，清除人体内部自由基，被广为研究和应用[7]。Haragehi[8]等研究发现辣蓼叶的水溶性组分中具有黄酮苷和黄酮苷元类物质，主要成分为异槲皮苷，槲皮素，7,4-二甲基榭皮素，和3-甲基槲皮素；Zhao[9]等从辣蓼叶中分离鉴定出10中黄酮类化合物，其中6种为黄酮醇类化合物，4种为黄酮苷类化合物，经电子自旋共振谱技术(ESR)和UV-Vis 分析法鉴定出这10种物质含有较强的抗氧化结构，经抗氧化实验发现，2''-O-(3,4,5-三羟基苯酚) 槲皮苷抗氧化能力最强。Chan[10]等对东南亚药用植物抑菌活性和抗氧化活性进行研究时发现，辣蓼的水煮液具有强抗氧化性。林燕文[11]对2种蓼科植物进行体外抑菌实验，探究发现辣蓼水煮液对革兰氏阳性菌(枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠埃希菌)均有不同的抑制效果，对黑曲霉、青霉、酿酒酵母这些真菌没有抑制效果。

近年来关于辣蓼中黄酮的提取研究渐有报道，主要提取方法有回流浸提法、超声波和微波提取法[12-15]。传统的回流提取法耗时长，不利于工业化生产，超声波技术提取天然产物中的黄酮类化合物是目前应用最为广泛的一种新方法，超声波提取辣蓼中黄酮的研究报道较少。本研究旨在应用超声波辅助法对辣蓼黄酮的提取进行工艺优化，对工业化生产辣蓼中黄酮类化合物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

辣蓼：于2014年10月采自浙江宁波慈溪市杨梅村，洗净，自然晾干，粉碎，过40目筛，保存于-20℃中。

试剂：芦丁(Rutinu) 购买于上海源叶生物科技有限公；亚硝酸钠(NaNO2)，硝酸铝[Al(NO3)3]，氢氧化钠(NaOH)，乙醇等均为分析纯。

仪器：高速中药粉碎机；超声波清洗仪：宁波新芝 SB-5200；紫外分光光度计：北京普析tu-1810；分析天平：梅特勒多利多AM104，台式离心机：湘仪 L600。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标样采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定黄酮化合物[15-17]。精密称取称取芦丁标准品10 mg，精确到0.000 1g，加入一定量的乙醇溶液，置于水浴锅中微热使其溶解，冷却后用60%的乙醇水溶液定容至50 mL，摇匀，得芦丁标准溶液(0.2 mg/mL)，备用。

准确吸取芦丁标准溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，在避光条件下，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入10% 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min， 最后加入4.0 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液，用60%的乙醇溶液补齐至刻线，摇匀。于避光处静置15 min，在510nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。

1.2.2 单因素试验

采用超声波辅助法对辣蓼中黄酮类化合物进行提取，研究不同超声温度、料液比、乙醇浓度、超声时间4个因素对黄酮类化合物提取效果的影响。

1.2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，对所用的四个因素设计正交试验，以确定超声波辅助法的最佳工艺条件。

1.2.4 乙醇浸提法

在最佳超声条件下，不采用超声波辅助技术，用乙醇直接浸提。以确定超声波辅助法的优势。

1.2.5 超声波法提取辣蓼中总黄酮及含量测定

1) 工艺流程

辣蓼粉末→按照一定的料液比加溶剂浸润→在一定条件下超声处理→离心过滤→定容→样品测定

2) 辣蓼黄酮的提取与测定方法

准确称取3.0 g辣蓼粉末，于150 mL锥形瓶中，按照一定的料液比加入乙醇溶液，在一定条件下进行超声波辅助提取，提取液经离心过滤，将滤液转移到250 mL容量瓶中，定容，静置得待测液。准确吸取1.0 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照1.2.1绘制芦丁标准曲线过程中，化学试剂的加入方法，在510 nm处定其吸光度，每组重复3次提取实验。利用标准曲线回归方程计算得提取液中黄酮类化合物含量。

黄酮计算公式：黄酮类化合物含量(mg/g)=nCV/(m×1000)

式中：C—从标准曲线上得到的芦丁的浓度(mg/L)；

n—提取液的稀释倍数；

V—提取液体积(mL)；

m—样品质量(g)。

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线

以芦丁为标准品，测得标准曲线(见图1)，由图1可以看出R2达到0.999 5，说明本实验结果精确度高，在实验室条件下得出的标准曲线是准确可信的。

图1 黄酮标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对黄酮提取的影响

按照1.2.5的试验方法，选择不同的料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)，在超声温度为30 ℃，乙醇浓度为60%，超声30 min的条件下，对比黄酮类化合物提取效果，以选取合适的料液比。

图2 料液比对提取黄酮提取的影响

如图2所示，随着料液比的增大，黄酮提取率增加，当料液比为1∶50时，辣蓼中黄酮提取最充分。从图2可见，在料液比1∶30～1∶50范围内，黄酮的提取量增加缓慢，但料液比过大，增大溶剂用量的同时，在生产上还会影响黄酮提取液的浓缩。因此，采用1∶40的料液比比较合理。

2.2.2 乙醇浓度对黄酮提取的影响

按照1.2.5的试验方法，选择不同的乙醇浓度(20%，40%，60%，80%，100%)在料液比为1∶20，超声温度为30 ℃，超声30 min的条件下，对比黄酮类化合物提取效果，以选取合适的乙醇浓度。

由图3可知，随着乙醇浓度的升高，辣蓼黄酮的提取量增加，但当乙醇浓度达到60%后，其提取量不增反降。可能是随着乙醇浓度增加，提取液中一些色素等醇溶性成分增多，干扰黄酮类物质的检测，或与乙醇反应应，从而导致黄酮类化合物提取效果下降[18-19]。故，60%的乙醇作为溶剂最为合适。

图3 乙醇浓度对提取黄酮提取的影响

2.2.3 超声温度对黄酮提取的影响

按照1.2.5的试验方法，选择不同的超声温度(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50℃，60 ℃)，在料液比为1∶20，乙醇浓度为60%，超声30 min的条件下，对比黄酮类化合物提取效果，选取合适的温度。

图4 超声温度对提取黄酮提取的影响

由图4可见，提取温度的升高，导致黄酮提取量先增加后减少，在50 ℃时黄酮类物质量最高，超过50 ℃时，黄酮类物质含量反而降低，这可能是由于，温度过高会破坏一些黄酮类化合物的结构，并且温度升高，一些醇溶性杂质成分增加，从而影响黄酮类物质的提取[19]。所以提取温度在50 ℃为最适。

2.2.4 超声时间对黄酮提取的影响

按照1.2.5的试验方法，选择不同的超声时间(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃)，在料液比为1∶20，乙醇浓度为60%，超声温度为30 ℃的条件下，对比黄酮类化合物提取效果，以选取合适的超声时间。

由图5可知，在一定时间范围内，提取越久，辣蓼黄酮类物质的量越多。但超过50 min后，黄酮类物质的提取量有所下降。可能是一些黄酮类物质结构不稳定，时间久被破坏，加之有溶出杂质，对黄酮类物质的量有影响[19-20]。因此，最佳提取时间应为50 min。

图5 超声时间对提取黄酮提取的影响

2.3 正交实验

在单因素试验基础上，对乙醇浓度、料液比、超声温度和时间4个因素进行L9(34)正交试验设计。正交因素水平见表1，试验结果及极差分析见表2。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验及结果分析表

由表2可知，选择各因子在同一水平下的平均试验指标之和k最高的为最优水平，得出超声波对提取辣蓼中黄酮类化合物效果的影响从大小依次为：C>A>D>B。最佳条件是：乙醇浓度60%，料液比1∶45，超声温度50 ℃，提取时间50 min。即提取工艺组合A2B3C2D2。

由方差分析表3可知，3个因素，即超声温度乙醇浓度和超声时间达到极显著水平(P<0.001)料液比对水平不显著(P=0.182)，说明超声温度，乙醇浓度和超声时间3个因素对辣蓼黄酮类化合物的提取有显著影响，料液比对黄铜类化合物的影响不显著，因此在考虑经济的条件下，可以选择1∶35的料液比。由表4可知在超声温度、乙醇浓度、超声时间各水平之间存在显著差异，在料液比因素中，B2和B3之间差异不显著。

表3 方差分析表

表4 正交试验Duncanny's多重比较

注：大写字母不同表示水平之间存在显著差异，相同则表示水平之间差异不显著。

2.4 验证试验

由上述正交试验结果可知， A2B3C2D2组合为最优，按照最优组合，进行3次重复验证试验。

表5 辣蓼中黄酮提取试结果验证

由表5可知，在A2B3C2D2组合的条件下，黄酮含量平均为55.8 mg/g。

2.5 乙醇浸提试验

在上述正交试验得出最佳A2B3C2D2组合下，不采用超声波辅助，直接进行浸提，进行3次重复试验。

表6 乙醇浸提法黄酮含量

由表6可知在常规的乙醇浸提条件下，黄酮类化合物的含量为28.4 mg/g。

3 讨 论

(1)单因素试验和正交试验的结果表明，超声波辅助法对提取辣蓼黄酮类化合物影响大小为：乙醇浓度>超声温度> 料液比>超声时间。提取的最佳超声条件是：乙醇浓度为60%，料液比为1∶45，提取时间为50 min，超声温度为50℃。在此工艺条件下可提取得到黄酮类化合物的含量为55.8 mg/g。

(2)超声波辅助法得到的黄酮类化合物的含量，是相同条件下乙醇浸提法含量的2倍。比王振堂等[12]用乙醇回流法得到46.4 mg/g蓼实总黄酮和杨家凯等[20]采用高速匀浆法得47.5 mg/g辣蓼总黄酮要高。这与蔡玲等[15]利用超声波法得到水蓼中的总黄酮的量为38.2 mg/g,并高于传统回流法的提取率。并且本试验进一步验优化了超声波辅助提取辣蓼黄酮类化合物的工艺条件。

采用超声波辅助法可以有效提取辣蓼中黄酮类化合物，并且具有高效、环保、节能等优点，可以用于后续辣蓼中黄酮类化合物的应用及研究中。

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Ultrasonic Technology for Extracting Flavonoids fromPolygonumhydropoper

Zhang Jing1, Huang Shiwen, Xu Shaoqing3, Tian Fang4, Ni Sui1*

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Cixi Agricultural office of Henghe, Cixi 315318, China; 3. Cixi Forestry Technology Extension Centre of Zhejiang, Cixi 315300,China; 4. Research Institute of Gang Yagou Healthy Food and Biotechnology, Ningbo 315205, China)

Flavonoids are one of the main active ingredients inPolygonumhydropoper. The ultrasonic extraction technology was studied to extract the flavonoid compounds from whole plant ofPolygonumhydropoper. The influence of extract time, solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, and temperature were analyzed. The optimum levels were analyzed through single-factor test and orthogonal experiment. The optimum extraction technology was as follows: ethanol concentration 60%, solid-to-liquid ratio 1∶45, temperature 50 ℃, extraction time 50 min. Under these technological conditions, the content of the extraction was 55.8 mg/g. Ultrasonic extraction technology could facilitate the efficient extraction of total flavonoids fromPolygonumhydropoper.

Polygonumhydropoper; flavonoid compounds; ultrasonic; extraction technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.006

2016-03-28

宁波市科技富民项目(2015C10023)；慈溪市农业局农业科技项目(CN201417)。

张晶(1990—)，女，硕士研究生，研究方向:植物天然成分分析。E-mail:13857478403@163.com

R284.2

A

1006-9690(2016)05-0025-05

*通讯作者：倪穗，教授，研究方向:植物生物技术。