TBC1D1/4在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运中的作用

王倩 傅力

天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学系(天津 300070)

TBC1D1/4在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运中的作用

王倩 傅力

天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学系(天津 300070)

TBC1D1(Tre-2/BUB2/cdc1 domain family 1)和TBC1D4(又名Akt Substrate of 160 kDa，AS160)均为骨骼肌细胞内的GTP酶激活蛋白(Rab-GTPase activating proteins,Rab-GAP)，参与骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)在细胞内的转位过程，调节骨骼肌细胞葡萄糖转运。最新研究表明，TBC1D1和TBC1D4在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运过程中发挥重要作用，骨骼肌细胞胰岛素信号通路活性下降引起GLUT4转位异常、导致骨骼肌细胞葡萄糖转运能力下降。有氧运动能够显著改善机体能量代谢水平，已被广泛应用于临床肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢性疾病的治疗。本文综述TBC1D1和TBC1D4在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运中的作用，以期为运动防治代谢性疾病的机制研究提供理论依据。

TBC1D1；TBC1D4；有氧运动；骨骼肌；葡萄糖转运

1 TBC1D1/4概述

TBC1D1和TBC1D4同属TBC1D Rab-GTP酶激活蛋白家族，其氨基酸序列的基本结构都包含一个Rab-GAP区、两个磷酸酪氨酸结合区(phosphotyrosine-binding,PTB)和一个钙调节素结合域(Calmodin binding domain,CBD)，TBC1D1和TBC1D4的Rab-GAP区氨基酸序列的同源性达79%[1，2]。到目前为止，通过PAS抗体(phospho Akt substrate antibody)能够和TBC1D1和TBC1D4上的丝氨酸/苏氨酸残基发生反应这一特性，发现TBC1D4共有8个磷酸化位点(丝氨酸318、丝氨酸341、丝氨酸570、丝氨酸588、苏氨酸642、丝氨酸666、丝氨酸704、丝氨酸751)[3，4]，其中包括5个典型的AKT磷酸化位点；而TBC1D1有5个磷酸化位点(丝氨酸235、丝氨酸237、苏氨酸596、丝氨酸660、丝氨酸700)，包括2个典型的AKT磷酸化位点，均毗邻两个PTB区的上游[5]。

TBC1D1和TBC1D4均是进化过程中高度保守的蛋白，小鼠和人类之间的同源性达90%。但是，TBC1D1和TBC1D4具有种属特异性表达的特点，表现为TBC1D1表达于所有物种，而TBC1D4只在脊椎动物中表达。在同一物种的不同组织中其表达也不尽相同，小鼠酵解型肌纤维中多见TBC1D1，而脂肪组织几乎不表达TBC1D1；TBC1D4主要表达于小鼠心脏、脂肪组织和氧化型肌纤维[6-8]。除此之外，不同类型骨骼肌纤维中TBC1D1和TBC1D4的表达量差异很大，小鼠胫骨前肌中TBC1D1的表达量分别是趾长伸肌和比目鱼肌的3倍和10倍；小鼠趾长伸肌和胫骨前肌中TBC1D4的表达量均为比目鱼肌的1/10[8]。然而，TBC1D1和TBC1D4在大鼠不同肌肉组织类型中的表达量并无差异，在人类腓肠肌、胫骨前肌和比目鱼肌中的表达量也没有显著差异[8]。

众所周知，有氧运动可显著提高骨骼肌细胞葡萄糖代谢水平。有氧运动通过激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)，引起TBC1D1和TBC1D4发生磷酸化，促进GLUT4囊泡转位至细胞膜，加速骨骼肌细胞葡萄糖转运[9]。除此之外，餐后血糖升高时，胰岛β细胞分泌释放胰岛素入血，胰岛素经血液循环作用于骨骼肌细胞，与细胞膜表面受体结合引起胰岛素受体底物(IRS)磷酸化，后者进一步磷酸化PI3K，并通过PI3K/AKT途径磷酸化TBC1D1和TBC1D4，促进骨骼肌细胞葡萄糖转运[10]。本文主要综述TBC1D1和TBC1D4通过有氧运动激活AMPK促进骨骼肌细胞葡萄糖转运。

2 TBC1D1在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运过程中的作用

有氧运动以及AMPK激活剂AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside)均能显著提高骨骼肌细胞TBC1D1磷酸化水平，增加细胞葡萄糖转运。机体进行有氧运动时，骨骼肌细胞AMPK活化后促进TBC1D1发生磷酸化，磷酸化的TBC1D1进而促进细胞葡萄糖转运。AMPK在所有哺乳动物细胞中作为能量感受蛋白存在，在进化过程中高度保守。在运动情况下，机体组织细胞能量代谢水平升高，ATP消耗增加，造成细胞内高AMP/ATP状态，从而激活AMPK。AMPK的激活会促进能量产生过程，如葡萄糖转运和脂肪酸氧化，抑制能量消耗过程，如蛋白质和脂质的合成。有氧运动下，在小鼠及人类骨骼肌细胞中都已证实AMPK是TBC1D1的上游激酶，且发挥激酶作用的是AMPKα2/β2/γ3三聚体[11]。此外，体外实验也表明，人类骨骼肌细胞中TBC1D1是AMPK的主要作用底物[12]。

GLUT4是参与骨骼肌细胞葡萄糖转运的主要蛋白，安静状态下分布于骨骼肌细胞内，受运动或胰岛素等刺激时转位至细胞膜上并与细胞膜融合。融合后的GLUT4成为葡萄糖转运载体，运载葡萄糖进入细胞内。GLUT4以多组分囊泡的形式发挥运载葡萄糖作用，GLUT4囊泡除了含GLUT4之外，主要蛋白还包括胰岛素调节性氨肽酶(Insulin-regulated amino peptidase, IRAP)、转铁蛋白受体、分泌载体膜蛋白、6-磷酸甘露糖受体糖蛋白、SNARE(Soluble N-ethylmaleimidesensitive fusion attachment protein receptors)和GTP结合蛋白。胞浆中的Rab蛋白通过与GTP结合的活化形式和与GDP结合的失活形式调控GLUT4囊泡的转位。研究表明，人类基因组中存在60余种Rab蛋白，骨骼肌细胞中参与葡萄糖转运的Rab蛋白包括Rab2, Rab8b,Rab10和Rab14[13，14]。基础状态下，骨骼肌细胞内TBC1D1通过与IRAP这一GLUT4囊泡的主要蛋白质相互作用定位于GLUT4囊泡上，成为GLUT4囊泡的一部分[15]，此时TBC1D1不发生磷酸化，具有Rab-GAP活性，细胞内Rab蛋白装载GDP，GLUT4囊泡不能转位至细胞膜，导致葡萄糖不能被运载进入细胞内；运动情况下，TBC1D1在AMPK的刺激下发生磷酸化，失去Rab-GAP活性，细胞内Rab蛋白装载GTP致GLUT4囊泡转位至细胞膜，葡萄糖被运载进入细胞内(详见图1)。实验证实，TBC1D1与GLUT4囊泡的结合对骨骼肌细胞内GLUT4囊泡的稳定性发挥重要作用，TBC1D1的缺失或突变会导致大量GLUT4囊泡进入溶酶体降解[16]。

与野生型小鼠相比，在有氧运动刺激下，TBC1D1基因敲除(TBC1D1-/-)小鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运能力显著降低，而由胰岛素刺激的葡萄糖转运并未发生改变，同时TBC1D1-/-小鼠的运动能力显著下降，提示TBC1D1在有氧运动引起的葡萄糖转运过程中发挥重要作用。但是TBC1D1的缺失对小鼠的最大运动速度并无影响[16]。然而，TBC1D1-/-小鼠骨骼肌细胞线粒体氧化磷酸化蛋白水平、非酯化脂肪酸水平以及糖原水平与野生型小鼠相比均没有显著变化[16]。与野生型小鼠相比，TBC1D1-/-小鼠趾长伸肌中GLUT4的表达水平减少了50%，而TBC1D1-/-小鼠和野生型小鼠趾长伸肌中GLUT4 mRNA表达水平没有显著差异，表明TBC1D1可能对GLUT4转录后修饰过程有潜在影响[17]。TBC1D1-/-小鼠骨骼肌细胞中GLUT4表达水平的显著降低只发生于TBC1D4表达较少的肌肉类型，如趾长伸肌和胫骨前肌中，说明在骨骼肌细胞葡萄糖转运中TBC1D4对TBC1D1的缺失具有补偿效应。值得注意的是，TBC1D4-/-小鼠骨骼肌细胞中GLUT4表达水平的降低发生在胫骨前肌和脂肪组织中[18]。与野生型小鼠相比，TBC1D1-/-小鼠经有氧运动后，其骨骼肌细胞甘油三酯水平显著下降，说明在有氧运动干预下，TBC1D1-/-小鼠骨骼肌细胞脂肪酸氧化水平增加[16]。实验证实，人类骨骼肌细胞中，TBC1D1不同磷酸化位点对不同的刺激产生磷酸化效应，TBC1D1-丝氨酸237、丝氨酸660和丝氨酸700位点只在运动干预下发生磷酸化，而TBC1D1-苏氨酸596在运动干预和胰岛素作用下均能发生磷酸化改变[11]。

与野生型小鼠相比，有氧运动对AMPKα2基因敲除(AMPKα2-/-)小鼠骨骼肌细胞中TBC1D1磷酸化位点的磷酸化作用明显降低[19]，因此，有氧运动下，AMPKα2-/-小鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运显著减少[20]，但是有氧运动对AKT失活小鼠骨骼肌细胞中TBC1D1磷酸化位点的作用以及葡萄糖摄入影响没有异常[21]。野生型小鼠趾长伸肌收缩会增加TBC1D1-丝氨酸237和TBC1D1-苏氨酸596的磷酸化，但是AMPKα2-/-小鼠中，在趾长伸肌收缩作用下，任何磷酸化位点都没有磷酸化水平的增加[21]。同时，有氧运动也会增强骨骼肌细胞中TBC1D1和14-3-3蛋白的结合能力，但是AMPKα2-/-小鼠骨骼肌细胞中这种结合作用不会在有氧运动作用下增强，而AKT的失活不会影响有氧运动下骨骼肌细胞中TBC1D1和14-3-3蛋白的结合作用的增强[21]。跑台运动干预能够增加小鼠趾长伸肌TBC1D1-丝氨酸237、苏氨酸596、丝氨酸660和丝氨酸700的磷酸化水平，但在比目鱼肌中以上各个磷酸化位点的磷酸化水平均未发生改变，提示有氧运动对TBC1D1磷酸化活性的影响具有骨骼肌类型特异性，即酵解型快肌纤维的TBC1D1磷酸化水平易受运动干预的影响，而氧化型纤维TBC1D1磷酸化水平无显著变化。此外，人体实验表明，骨骼肌细胞TBC1D1还参与调控细胞代谢的能量感受信号AMPK相关途径，但具体机制尚需进一步研究来证实[22]。

图1　TBC1D1/4调节骨骼肌细胞葡萄糖转运作用模式

3 TBC1D4在有氧运动促进骨骼肌细胞葡萄糖转运中的作用

骨骼肌细胞中TBC1D4主要在胰岛素作用下发生磷酸化从而促进葡萄糖转运，但有研究表明，TBC1D4也是骨骼肌细胞中AMPK的作用靶点，同时AMPK的激活剂AICAR也能够增加TBC1D4的磷酸化水平[24]。表达TBC1D4突变体的骨骼肌细胞中，有氧运动刺激的葡萄糖转运降低20%～25%，进一步佐证了TBC1D4参与有氧运动刺激的葡萄糖转运。

研究表明，TBC1D4-苏氨酸642位点磷酸化是骨骼肌细胞葡萄糖转运机制的关键步骤[23]。有氧运动刺激下，骨骼肌细胞中TBC1D4以与TBC1D1相同的方式作用于GLUT4囊泡，从而对葡萄糖转运发挥作用(详见图1)。实验证明，当骨骼肌细胞中表达能够抑制TBC1D4磷酸化的突变体时，有氧运动刺激的葡萄糖转运会明显减少。小鼠胫骨前肌中TBC1D4会影响有氧运动刺激的葡萄糖转运，但是对胰岛素刺激的葡萄糖转运没有影响[25]，其中的机制尚不清楚。质谱分析显示，与其他骨骼肌组织类型相比，有氧运动后小鼠腓肠肌中TBC1D4有更高的磷酸化水平[26]。当小鼠进行30分钟跑台运动后，其腓肠肌组织中TBC1D4-苏氨酸642磷酸化活性即增加[27]。而即使小鼠进行跑台运动达60分钟后，其趾长伸肌组织中TBC1D4上所有磷酸化位点均未发生变化[28]，同样有氧运动亦未引起比目鱼肌组织TBC1D4的磷酸化活性变化，提示有氧运动对TBC1D4磷酸化水平的增强作用具有骨骼肌类型表现特异性，但是这种特异性变化的机制目前尚不清楚。而当大鼠进行有氧运动后3～4 h，其胫骨前肌组织中TBC1D4-苏氨酸642、丝氨酸588的磷酸化水平均显著提高[28]。众所周知，细胞内的Ca2+是骨骼肌收缩的必要条件，小鼠胫骨前肌组织中，表达CBD突变体的TBC1D4不会影响胰岛素刺激的葡萄糖转运，但是会显著抑制有氧运动引起的葡萄糖转运[29]，提示Ca2+也是有氧运动增强骨骼肌细胞中TBC1D4磷酸化水平的必要条件。

耐力运动可增加氧化型肌纤维中TBC1D4的磷酸化水平。正常成年男性进行自行车训练(最大摄氧量67%)时，运动持续时间在30分钟以内，骨骼肌组织TBC1D4的磷酸化水平未发现显著变化，运动持续时间达到60分钟时，骨骼肌组织TBC1D4的磷酸化水平明显升高，且随着运动持续时间的延长其磷酸化水平随之增加，并在90分钟时达到峰值[26]。虽然正常成年男性有氧运动持续时间达到60分钟时，骨骼肌组织TBC1D4磷酸化水平才会升高，但是14-3-3蛋白与TBC1D4的结合能力只在运动结束后即刻有所增加[28]。最新研究表明，在持续时间为60分钟的电刺激实验中，小鼠骨骼肌细胞中TBC1D4的磷酸化水平升高是短暂的，但是葡萄糖转运一直持续进行[3]，提示有氧运动刺激的骨骼肌细胞中TBC1D4磷酸化和葡萄糖转运并不是伴随进行的。与其同源物TBC1D1一样，人类骨骼肌细胞中TBC1D4不同磷酸化位点对不同的刺激产生磷酸化效应，TBC1D4-丝氨酸588、丝氨酸751仅在运动干预下发生磷酸化，TBC1D4-丝氨酸318只在胰岛素作用下发生磷酸化，TBC1D4-丝氨酸341、苏氨酸642和丝氨酸704位点在运动干预和胰岛素作用下均能发生磷酸化，而TBC1D4-丝氨酸666在运动干预和胰岛素作用下均不能发生磷酸化[25]；与TBC1D1不同的是，有氧运动对TBC1D4的磷酸化作用与AMPKα2/β2/ γ1三聚体相关[11]。与有氧运动不同，急性运动刺激下，正常成年男性骨骼肌组织TBC1D4的磷酸化水平在运动结束即刻会降低，直到运动结束后几小时有所增加，提示不同运动形式对骨骼肌组织TBC1D4的作用机制可能有所不同[30]。

4 小结

在有氧运动过程中，TBC1D1和TBC1D4共同促进骨骼肌细胞葡萄糖转运，同时二者具有补偿效应。TBC1D1已被证实是骨骼肌细胞AMPK的主要作用底物，虽然TBC1D4主要在胰岛素刺激的葡萄糖转运中发挥作用，但有研究表明其对有氧运动刺激的葡萄糖转运也具有促进效应[29]。有氧运动激活AMPK，进而磷酸化骨骼肌细胞中的TBC1D1和TBC1D4，使其丧失Rab-GAP活性，从而促进GLUT4囊泡向细胞膜的转位，促进骨骼肌细胞中葡萄糖的摄入；与此同时，TBC1D1和TBC1D4对细胞内GLUT4囊泡的稳定性也具有重要作用。探索有氧运动下TBC1D1和TBC1D4在骨骼肌细胞葡萄糖转运中的作用对于胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的预防及治疗具有积极的意义。但是目前对TBC1D1和TBC1D4在骨骼肌细胞葡萄糖转运中作用的具体机制所知甚少，仍然有许多问题需要更为深入的探讨。

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2016.03.11

国家自然科学基金面上项目(31571220,31671237),天津市科技项目计划(13ZCZDSY02000)

傅力，Email：lifu@tmu.edu.cn