细胞核内β-连环素表达水平在胃癌中的临床研究

高振武，翟弥弥，焦 鑫，张国友，葛 亮，王 玉，王圣刚

细胞核内β-连环素表达水平在胃癌中的临床研究

高振武1，翟弥弥2，焦 鑫3，张国友3，葛 亮3，王 玉1，王圣刚3

目的：探讨细胞核内β-连环素表达水平与胃癌临床病理因素的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测77例胃癌组织及30例癌旁组织细胞核中β-连环素表达水平，分析其与肿瘤组织浸润深度、淋巴结转移、组织分化程度、临床分期的关系。以无病生存时间（DFS）和总生存时间(OS)为评价指标，探讨β-连环素与胃癌患者预后的关系；ROC曲线衡量β-连环素在评估胃癌患者预后中的价值。结果：胃癌肿瘤组织细胞核内β-连环素的表达水平与年龄、性别无关（P＞0.05），与肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移、TNM分期以及肿瘤的分化程度有关。Kaplan-Meier生存曲线显示：肿瘤组织细胞核内β-连环素阴性表达者DFS(26月)和OS(38月)优于阳性表达者DFS（18月）和OS（24月）（P＜0.05）；COX多因素分析:细胞核内β-连环素的表达可以作为胃癌患者OS独立预后因素（HR=0.87，95%CI：0.54～2.34，P=0.03）；ROC曲线显示，β-连环素在评估胃癌患者预后中具有中等价值（曲线下面积为0.82）。结论:胃癌组织细胞核内β-连环素表达水平与胃癌的TNM分期、淋巴结转移、浸润深度呈正相关性，与肿瘤的分化程度呈负相关性，可能是胃癌患者预后较差的标志物。

β-连环素；胃癌；免疫组化；预后；细胞核

胃癌在我国的发病率逐年增高，在所有恶性肿瘤中的发病率和死亡率排名第一[1]。由于其高转移率和高复发率，术后辅助化疗在其整个治疗系统中具有重要的地位[2-4]。β-连环素是具有介导信号转导和细胞黏附的多功能蛋白，作为Wnt信号转导通路枢纽中的重要组成部分，在肿瘤的发生和发展中具有重要作用[5]。国内和国外[6]学者对β-连环素和肿瘤之间的关系进行了研究，大多数学者认为β-连环素与肿瘤的发生呈正相关。本研究利用免疫组化SP法检测胃癌组织细胞核内β-连环素的表达水平，研究胃癌患者细胞核内β-连环素的表达水平与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取经潍坊医学院附属医院2008年1月―2010年1月病理检查确诊胃癌(取自病理科存档蜡块)77例标本和30例癌旁组织。77例均行远端胃癌根治术，术前未经放疗、化疗。术后Ⅱ、Ⅲ期患者均经过6个周期的化疗（奥沙利铂、替吉奥）。男50例，女27例；年龄 42～76岁（平均59.1岁）。无淋巴结转移25例，淋巴结转移52例。按组织学分级分组，低分化16例，中分化17例，高分化44例。按NCCN（2015年）指南TNM分期系统行分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期25例，Ⅲ期24例。

1.2 试剂及仪器设备 β-连环素鼠抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗Sunpoly-HⅡ聚合物检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，SP免疫组化试剂盒、ZLI-9032浓缩型DAB显色试剂盒、DAB显色增强剂均购自北京中杉生物科技有限公司，山羊血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。倒置显微镜（日本Olympus公司），Image-Pro Plus图像分析软件（美国Media Cybernetics公司），Dh-cg300图像分析系统（中国大恒集团有限公司）。

1.3 检测方法 免疫组织化学SP法检测β-连环素在胃癌组织细胞核中的表达。将病理组织标本的石蜡块连续切片，脱腊处理，在0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲溶液中高温高压进行抗原修复。按SP三步法免疫组化染色试剂盒说明书提供的实验步骤进行操作。

1.4 结果判定 免疫组化产物阳性呈浅黄色-棕褐色细颗粒状，半定量方法判定并进行评分。每例切片随机观察8个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占的百分比。按阳性细胞所占的百分比评分：0分为阳性细胞数＜5%，1分为阳性细胞5%～24%，2分为阳性细胞25%～49%，3分为阳性细胞50%～74%，4分为阳性细胞≥75%。按染色强度评分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。两项相加后分为4级，0～1分为﹙－﹚，2分为﹙＋﹚，3～4分为﹙＋＋﹚，＞5分为﹙＋＋＋﹚，﹙＋～＋＋＋﹚均为阳性[7]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，两组样本率的比较采用独立样本2×2列联表资料的χ2检验，多个独立样本率的比较采用独立样本R×C列联表资料的χ2检验。采用Ka⁃plan-Meier生存曲线进行生存分析评价，Log rank检验进行生存率的比较。影响生存期的相关因素分析采用COX多因素回归分析法。ROC曲线进行准确性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-连环素在胃癌组织细胞核内的表达 β-连环素在胃癌组织细胞核中表达丰富，呈棕黄色至棕褐色表达，癌旁组织细胞核内表达水平较少（P＜0.001）。见表1。胃癌组织细胞核内β-连环素的表达水平与患者的年龄、性别无关（P＞0.05），与TNM分期、淋巴结转移情况、浸润深度、分化程度有关（P＜0.05）。见表2。胃癌的分期越晚，分化程度越低，细胞核内β-连环素的表达水平越高。淋巴结转移患者胃癌组织中β-连环素的表达水平明显高于无淋巴结转移者。T3、T4期胃癌患者β-连环素的表达水平明显高于T1、T2期。见图1。

2.2 胃癌组织细胞核内β-连环素的表达与预后的关系 对77例患者进行随访，总体生存时间（OS）从手术开始到死亡或随访结束，无病生存时间（DFS）从手术开始到出现复发或转移，随访时间为50个月。Kaplan-Meier生存曲线显示，β-连环素阳性表达的胃癌患者的中位生存时间为26月，阴性表达者中位生存时间为18月，Log rank检验提示组织细胞核内β-连环素阴性表达者(38月)的OS优于阳性表达者(24月)，差异具有统计学意义（P＜0.05）。COX单因素回归分析结果显示：胃癌患者的性别、年龄与术后DFS（P值分别为0.48、0.69）和OS（P值分别为0.80、0.54）无关，差异无统计学意义；肿瘤的浸润深度、组织分化与胃癌患者术后DFS（P值分别为＜0.05、＜0.05、0.001）和OS（P值分别为＜0.05、＜0.05、0.003）相关，差异具有统计学意义。COX多因素回归分析结果显示：β-连环素阳性表达与DFS无关（HR=0.56，95%CI：0.45～3.12，P=0.06），不能作为胃癌患者的独立预后因素，β-连环素阳性表达与OS相关（HR=0.87，95%CI：0.54～2.34，P=0.03），可能是胃癌患者的独立预后因素。见图2、3。

表1 胃癌组织和癌旁组织细胞核内β-连环素表达水平

表2 细胞核内β-连环素的表达水平与胃癌临床病理因素的关系

图1 细胞核内β-连环素表达

图2 细胞核内β-连环素表达与无病生存率的关系

图3 细胞核内β-连环素表达与总生存率的关系

2.3 胃癌组织细胞核内β-连环素的表达在评估预后中的价值 评估β-连环素在预测胃癌患者预后中的价值曲线如图4，ROC曲线下面积为0.82。提示其在评估胃癌患者预后中具有中等价值。灵敏度为78.2%，特异度为81.6%，最优截断值为β-连环素的阳性表达大于5分。

图4 ROC曲线评估β-连环素在胃癌患者预后中的价值

3 讨论

郭康等[8]发现，β-连环素是WNT信号通路中的一个重要因子。WNT是肿瘤干细胞分化的重要信号通路，β-连环素表达异常可使肿瘤细胞黏附功能丧失，导致肿瘤细胞易于浸润和转移。WNT信号通路异常激活会导致β-连环素在细胞质和细胞核内异常表达，激活细胞核中的基因，使细胞分裂增殖发生异常，最后发生癌变。Francis等[9]研究了β-连环素与前列腺癌的关系，提出β-连环素的超表达促进了前列腺癌的发生。Kim等[10]人的研究指出，β-连环素是Wnt信号通路中关键的核转录因子，细胞核内积累的β-连环素是激活致癌靶基因的关键一步。

Thakur等[11]的研究也提出，β-连环素在肿瘤的发生过程中起到促进作用。Ghahharia等[12]人的研究提出了β-连环素增加了肿瘤复发转移的风险。本研究中，β-连环素胃癌组织中的阳性表达率为66.2%，高于癌旁正常组织的26.7%。与上述的研究有同样的结果。杨聚鹏等[13]人的研究与我们的研究结果相似，β-连环素胃癌中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，并具有统计学意义。β-连环素表达水平与胃癌患者性别、性别无关，与分期TNM分期、淋巴结转移浸润有关。表明随着肿瘤浸润深度，细胞核内β-连环素阳性表达率增高。β-连环素表达阳性胃癌患者的DFS明显低于阴性表达者。本研究发现，高分化胃癌、中分化胃癌、低分化胃癌中β-连环素阳性表达率分别为54.5%、70.6%、93.8%。提示随着肿瘤分化程度的提高,细胞核内β-连环素阳性表达率逐渐下降。此外，细胞核内β-连环素的表达与胃癌淋巴结分期有关，随着淋巴结转移数目的增加，其β-连环素的阳性表达率增加。表明β-连环素促进肿瘤通过淋巴结发生转移。淋巴结发生转移是胃癌患者不良预后的因素，淋巴结浸润是肿瘤恶性程度高的一种临床表现。Qin等[14]通过敲除胃癌细胞抑癌基因FRZB后发现，β-连环素的表达水平升高，增强了肿瘤的侵袭性。研究结果与我们的相同。随着β-连环素的表达增加，肿瘤的侵袭性增强。

本研究利用免疫组化SP方法检测癌旁组织和胃癌组织细胞核内β-连环素的表达水平，研究组织细胞核内β-连环素的表达水平与胃癌患者DFS的关系，胃癌预后是我们研究的重点。研究中发现，Kaplan-Meier生存曲线示，细胞核内β-连环素阳性表达者的DFS明显低于阴性表达者。COX多因素分析提示，细胞核内β-连环素阳性表达是胃癌患者的独立预后因素。并用ROC曲线检测β-连环素在评估胃癌患者预后中具有中等价值，可作为胃癌患者预后不良的标志物。综上所述，细胞核内β-连环素的表达水平增高和胃癌发生密切相关，β-连环素可能会成为一种肿瘤监测蛋白，为临床上判断胃癌患者的预后提供依据。

目前大量肿瘤标志物已用于临床的诊疗，如甲胎蛋白[15]主要是在肝癌患者中高表达，CA199[16]在胰腺癌中高表达，但是没有一种特异性高的肿瘤标志物来指导胃癌的治疗和预后，β-连环素有可能成为一种特殊的肿瘤标志物指导胃癌的治疗和预防。我们的研究发现，细胞核内β-连环素的高表达预示胃癌患者预后不良，但需要多中心、大样本数据的证实。

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（收稿：2015-12-26 修回：2016-06-26）

（责任编辑 李 勇 屈振亮）

统计学方法记述要求

统计学符号一律按GB 3358-1982《统计学名词及符号》的有关规定，采用斜体排印。常用的符号有：(1)样本的算术平均数(中位数仍用M)，(2)标准差用s，(3)标准误用sx，(4)t检验用t，(5)F检验用F，(6)卡方检验用希文小写χ2，(7)相关系数用r，(8)自由度用希文小写υ，(9)概率用P。对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料特点和分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件及分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用χ2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析；对具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系做出全面、合理的解释和评价。统计学方法的记述不能笼统记录为SPSS或SAS软件，而应写明所用统计学方法的具体名称，如：成组设计资料均数比较的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等，必要时给出统计量的具体值（如：t=4.35，χ2= 5.33，F=12.09等）；在用不等式表示P值时，一般情况下选用P＞0.05、P＜0.05和P＜0.01 3种表达方式，无须再细分。当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）时，在给出显著性检验结果的同时，再给出95%可信区间。

The Clinical Studies of β-catenin Expression Levels in The Nucleus of Gastric Cancer

GAO Zhen-wu, ZHAI Mi-mi,JIAO Xin,et al. Department of Gastrointestinal Surgery,Weifang Medical College,Weifang (261000),China

Objective To investigate the relations between β-catenin expression level in the nuclei and the clinical pathological factors of gastric cancer. Methods Immunohistochemical SP method was used to de⁃tect β-catenin expression levels in gastric cancer tissue cell nucleus.The relationship between β-catenin and tu⁃mor infiltration depth,lymph node metastasis,tissue differential degree,clinical stages was studied.Regarding disease-free survival(DFS)and overall survival(OS)as evaluation indexes to discuss β-catenin element's rela⁃tionship with the prognosis of patients with gastric cancer.ROC curve was used to measure the value of β-catenin element in evaluation of the prognosis of patients with gastric cancer. Results β-catenin expres⁃sion level in the nuclei of gastric cancer tumor tissue was not related to age,gender(P＞0.05),but is associated with tumor infiltration depth(P＜0.01),lymph node involvement(P＜0.05),TNM staging(P＜0.05),and the differentiation degree of tumor(P＜0.05).Kaplan-Meier survival curves showed that DFS(26 months)and OS(38 months)in the patients of β-catenin negtive expression is better than DFS(18 months)and OS(24 months)in pa⁃tients of positive expression.Cox Multiple factors analysis showed β-catenin expression in the nuclei can be used as an independent prognostic factor in patients with gastric cancer(HR=0.87,95%CI:0.54～2.34,P= 0.03).ROC curve showed β-catenin had the same significance in evaluating the prognosis of patients with gas⁃tric cancer(area under the curve is 0.82). Conclusion β-catenin expression level in the nuclei of gastric can⁃cer was positively related to TNM staging,lymph node metastasis,and infiltration depth,but negatively to tumor differentiation degree.Its expression may be a marker of poor prognosis of patients with gastric cancer.

β-catenin；gastric cancer；immunohistochemical；the prognosis；cell nucleus

R735.2

A

1007-6948(2016)04-0331-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.04.006

1.山东省潍坊医学院（潍坊 261000）

2.山东省潍坊市人民医院消化内科（潍坊 261000）

3.山东省潍坊医学院附属医院胃肠外科（潍坊 261000）

张国友，E-mail:jiaoxin45@sina.com