异丙托溴铵雾化吸入治疗对COPD大鼠肺功能的保护作用及机制

熊英，张金娟，黄惠妍，李玲，陈燕，周忠

（1贵州医科大学，贵阳550025；2贵州医科大学附属医院；3贵阳市肺科医院）

异丙托溴铵雾化吸入治疗对COPD大鼠肺功能的保护作用及机制

熊英1，张金娟1，黄惠妍2，李玲1，陈燕2，周忠3

（1贵州医科大学，贵阳550025；2贵州医科大学附属医院；3贵阳市肺科医院）

目的 观察异丙托溴铵雾化吸入治疗对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺功能的保护作用，并探讨其作用机制。方法 48只SD大鼠随机均分为模型组、治疗3周组、治疗6周组和对照组，前三组制备COPD大鼠模型，停止熏烟后次日治疗3、6周组予以异丙托溴铵雾化治疗，4 mL／次，2次／d，分别治疗3、6周；对照组经气管插管注入生理盐水200 μL。采用BL-420系统记录呼吸曲线计算第0.3 s用力呼气容积（FEV0.3）、FEV0.3占肺活量百分比（FEV0.3／FVC），用血气分析仪检测血气指标：pH、PaO2、PaCO2，采用ELISA法检测IL-8、IL-10、TNF-α水平。结果

与模型组比较，治疗3周组、治疗6周组FEV0.3、FEV0.3／FVC、pH、PaO2、IL-10水平升高，PaCO2、IL-8、TNF-α水平降低（P均＜0.05），治疗6周组以上指标变化（除PaCO2外）更明显（P均＜0.05）。结论 异丙托溴铵雾化吸入治疗后COPD大鼠肺功能得到改善，该作用可能与降低IL-8、TNF-α水平，升高IL-10水平有关。

肺疾病，慢性阻塞性；细胞因子；异丙托溴铵；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以不完全可逆的气流受限为特征，呈持续进行性发展的疾病，是全球

发病率和病死率较高的重要疾病。研究表明，多种细胞因子参与该病的发生发展过程，且部分细胞因子水平与疾病的严重程度具有一定相关性［1～4］。2013年5月～2015年3月，本研究采用熏烟加气管内两次滴注脂多糖（LPS）的复合刺激法制备COPD大鼠模型，并予以异丙托溴铵雾化吸入治疗，观察治疗后COPD大鼠肺功能的变化，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1动物、仪器及试剂 成年SD大鼠48只，体质量（200±20）g，雄性，合格证号SCXK（军）2012-011，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。大鼠分笼饲养，每笼6只，动物室光照充足，通风和空调设备良好。有机玻璃熏烟箱（50 cm×40 cm×20 cm），自制；BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；HX200型呼吸流量换能器（北京新航兴业科贸有限公司）；血气分析仪（美国OPTITM CCA）；酶标仪（美国Bio Tek公司）；超声雾化器（402B型江苏鱼跃医疗设备有限公司）。“黄果树”牌过滤嘴香烟（贵州中烟工业有限责任公司）；LPS（索莱宝生物技术有限公司）；水合氯醛（成都金山化学试剂有限公司）；吸入用异丙托溴铵溶液（2 mL∶500 μg，法国Laboratoire Unither）；IL-8、TNF-α、IL-10试剂盒（上海沪鼎生物技术有限公司）。

1.2动物分组及COPD模型制备 SD大鼠随机分为4组：模型组、治疗3周组、治疗6周组和对照组，各12只。采用气管内两次滴注LPS及持续熏烟8周的方法造模。于造模第1、14天，各组大鼠麻醉［5］后行气管插管术，经插管向模型组和各治疗组动物气道内注入0.1%LPS溶液200 μL，对照组则经气管插管注入等量生理盐水。待大鼠清醒后放回鼠笼中饲养。造模第2～13天、第15～56天模型组和各治疗组予以被动吸烟（方法：在自制熏烟箱内同时点燃2只香烟，待其自行燃灭后更换，共点燃8支香烟，时间约45 min），1次／d，气管内注药当日均不予熏烟。对照组术后不予熏烟。模型制备成功的标准：留取模型组大鼠左肺组织，方法：颈总动脉插管抽尽全血后迅速开胸取出完整肺组织，生理盐水冲净表面血液，用10%中性甲醛固定，取左肺，石蜡包埋，切片，HE染色，行病理检查。镜下见肺泡壁变薄、断裂、肺泡腔胀大或破裂融合形成肺大泡；支气管黏膜坏死、脱落，并伴有炎性细胞浸润等肺气肿和支气管炎症的病理改变，结合肺功能指标下降说明造模成功。

1.3异丙托溴铵雾化治疗 各治疗组停止熏烟后次日予以异丙托溴铵雾化治疗。方法：将大鼠放入30 L的密闭盒内，用超声雾化器吸入0.025%的异丙托溴铵液4 mL，2次／d，分别治疗3、6周。对照组、模型组不予治疗。

1.4指标检测 模型组、对照组于熏烟结束后次日，治疗组大鼠分别于治疗3周（治疗3周组）、6周（治疗6周组）次日进行指标检测。①肺功能测定：各组麻醉后将Y型插管插入气管，插管一端经呼吸流量换能器与BL-420s生物机能实验系统连接，另一端接三通管。参照王翠茹等［3］的方法，在呼气末经三通管迅速向气管内推入6 mL空气（相当于被动深吸气），BL-420系统记录呼吸曲线，并计算第0.3 s用力呼气容积（FEV0.3）、FEV0.3占肺活量百分比（FEV0.3／FVC）。②血气指标检测：肺功能测定结束后，行颈左侧总动脉插管术抽取动脉血0.4 mL，用血气分析仪检测血气指标：pH、PaO2、PaCO2。③IL-8、IL-10、TNF-α水平测定：经动脉插管处抽取全血，于室温下静置20 min后离心（3 000 r／min，离心20 min）分离血清，-20℃冻存，采用ELISA法检测IL-8、IL-10、TNF-α水平。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肺功能比较 与对照组比较，模型组FEV0.3、FEV0.3／FVC降低（P均＜0.05）；与模型组比较，各治疗组FEV0.3、FEV0.3／FVC均升高（P均＜0.05），且治疗6周组以上指标升高最明显（P均＜0.05）。见表1。

表1　各组肺功能比较（±s）

表1　各组肺功能比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与治疗3周组比较，cP＜0.05。

组别nFEV0.3（mL）FEV0.3／FVC（%）对照组124.85±0.1580.71±2.53模型组123.29±0.20a54.83±3.32a治疗3周组123.96±0.50ab66.00±8.37ab治疗6周组124.36±0.24abc72.74±3.84abc

2.2各组血气指标比较 与对照组比较，模型组PaO2、pH下降，PaCO2升高（P均＜0.05）；与模型组比较，各治疗组动脉血pH、PaO2升高，PaCO2降低（P均＜0.05）；与治疗3周组比较，治疗6周组pH、PaO2升高（P均＜0.05）。见表2。

2.2各组血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比较 与对照组比较，模型组血清IL-8、TNF-α水平升高、IL-10水平下降（P均＜0.05）；与模型组比较，各治疗组血清IL-8、TNF-α水平降低、IL-10水平升高（P均＜0.05），且治疗6周组以上指标变化更明显（P均＜0.05）。见表3。

表2　各组血气指标比较（±s）

表2　各组血气指标比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与治疗3周组比较，cP＜0.05。

组别npHPaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）对照组127.35±0.0593.17±2.4839.17±4.07模型组127.18±0.05a50.33±2.88a56.83±3.92a治疗3周组127.30±0.03b60.67±5.04ab48.71±6.94ab治疗6周组127.34±0.05bc67.00±2.68abc47.28±5.93ab

表3　各组血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比较（ng／L，±s）

表3　各组血清IL-8、IL-10、TNF-α水平比较（ng／L，±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与治疗3周组比较，cP＜0.05。

组别nIL-8TNF-αIL-10对照组12356.16±6.93278.45±7.2456.42±3.15模型组12483.15±6.08a331.55±7.21a39.74±3.00a治疗3周组12383.71±8.36ab293.55±7.23ab50.91±2.75ab治疗6周组12364.10±8.69abc283.85±3.96abc54.94±2.59bc

3　讨论

COPD是一种以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症以及不完全可逆的气流受限为特征的慢性疾病，吸烟与反复感染是COPD最重要的致病因素。LPS是革兰阴性菌细胞壁成分，也可混杂在烟草的烟雾和空气污染颗粒中，研究表明LPS的慢性暴露可导致大鼠出现与COPD相同的病理生理学改变［4］。鉴于吸烟和LPS均是COPD的重要发病因素［5，6］，本研究采用了宋一平等［7］发明的气管内两次注入LPS加熏香烟的复合刺激法建立COPD大鼠模型。由于大鼠呼吸频率快，且动物无法配合，本实验参照安立等［8］的方法测定FEV0.3、FEV0.3／FVC代替FEV1、FEV1／FVC进行肺功能评估。

异丙托溴铵是临床常用的抗胆碱能药物，通过竞争支气管、肺组织中的M受体结合位点发挥竞争性拮抗作用，其阻断M受体后通过抑制细胞内环磷酸鸟苷生成、减少环磷酸腺苷降解，降低细胞内钙离子浓度，最终使气管、支气管平滑肌松弛，抑制气道腺体分泌，改善肺功能。IL-8是中性粒细胞重要的趋化因子，它主要由肺泡巨噬细胞产生，与COPD的发生发展有密切联系。国内外研究表明，COPD患者肺内IL-8的表达与肺功能下降密切相关［9，10］。TNF-α主要来源于活化的巨噬细胞，在COPD的发生发展中起关键作用［11］。IL-10是细胞因子中为数不多的有效抗炎因子，具有重要的抗炎作用，研究认为IL-10的减少可能是COPD气道炎症持续存在的原因［12］。目前已有细胞因子与COPD气道炎症严重程度相关的研究报道［13］，但对于药物治疗过程中细胞因子水平变化的研究甚少。鉴于以上三个因子与疾病的发生、发展密切相关，本实验监测了异丙托溴铵雾化吸入治疗过程中血清中IL-8、TNF-α和IL-10的水平，结果显示，与对照组比较模型组大鼠血清IL-8、TNF-α水平显著升高，IL-10水平显著下降，予以异丙托溴铵雾化吸入治疗后血清IL-8、TNF-α水平下降，差异均有统计学意义，其中治疗6周组最为显著；同时随着治疗时间延长IL-10水平逐渐升高，治疗6周后IL-10水平与对照组接近。说明通过异丙托溴铵治疗能有效改善COPD大鼠肺功能，其机制与降低炎症因子IL-8、TNF-α水平、升高IL-10水平，减轻气道炎症反应相关。

综上所述，支气管扩张药物异丙托溴铵雾化治疗能有效改善COPD大鼠肺功能，且随着治疗时间的延长，体内IL-8、TNF-α这类致炎因子水平逐渐下降，而保护性因子IL-10水平逐渐升高，提示体内炎症反应减轻。进而证实了异丙托溴铵能通过抑制体内致炎因子的产生和促进抗炎因子的表达发挥减轻气道炎症、改善肺功能的作用。

［1］李建华，王永志，林勇.CRF、IL-10在慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用研究［J］.医药论坛杂志，2009，30（10）：1-3.

［2］刘锦，刘阳，张晶晶，等.COPD急性期与缓解期血清C反应蛋白、前白蛋白、IL-8、TNF-α的变化分析［J］.海南医学院学报，2013，19（2）：180-182.

［3］王翠茹，李玲，韩云霞，等.补肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功及血气分析的影响［J］.时珍国医国药杂志，2012，23（1）：104-106.

［4］Brass DM，Hollingsworth JW，Cinque M，et al.Chronic LPS inhalation causes emphysema-like change in mouse lung that are associated with apoptosis［J］.Am J Resp Cell Mol Biol，2008，39（5）：584-590.

［5］刘君波，黄梦珊，余晨曦，等.慢性阻塞性肺疾病模型［J］.中国实验动物学报，2011，19（2）：129-133.

［6］杨海兵，沈洁，贾秋放，等.大气污染物和气象因素对心血管疾病影响的研究进展［J］.中华疾病控制杂志，2010，14（3）：266-268.

［7］宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及药物干预的影响［J］.中华内科杂志，2000，39（8）：51-52，73-74.

［8］安立，张洪玉，庞宝森，等.维A酸对大鼠实验性阻塞性肺气肿的预防作用及机制探［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25（6）：356-359.

［9］Yamamoto C，Yoneda T，Yoshikawa M，et al.Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of Interleukin-8［J］.Chest，1997，112（2）：505-510.

［10］单淑香，徐向英，刘艳霞，等.噻托溴铵吸入治疗COPD患者痰液炎症细胞计数及相关炎症因子表达变化［J］.山东医药，2016，56（3）：74-75.

［11］Mukhopadhyay S，Hoidal JR，Mukherjee TK.Role of TNF-alpha in pulmonary pathophysiology［J］.Respir Res，2006，7（1）：125.

［12］Takanashi SY.Hasegawa Y，Kanehira Y，et al.Interleukin-10 level in sputum is reduced in bronchial asthma，COPD and in smokers［J］.Eur Respir J，1999，14（2）：309-314.

［13］王晓青.慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-8、IL-10、α-HBDH、CRP及NO水平的变化［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26（12）：1262-1263.

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.010

R-332；R563

A

1002-266X（2016）21-0027-03

贵州省科技计划项目（黔科合LG字［2012］014号）。

黄惠妍（E-mail：349430709＠qq.com）

（2016-01-26）