免疫调节剂对亚临床型生殖器疱疹豚鼠模型排毒及IL-2和IL-4水平的影响

王利平，陆富永，魏　娇，杨凤元，蒙　坚，罗婧莹，程培华

免疫调节剂对亚临床型生殖器疱疹豚鼠模型排毒及IL-2和IL-4水平的影响

王利平，陆富永，魏娇，杨凤元，蒙坚，罗婧莹，程培华

王利平

目的观察匹多莫德联合铜绿假单胞菌注射液治疗亚临床型生殖器疱疹(genital herpes，GH)豚鼠模型的排毒及机体免疫的情况，借以揭示人类亚临床型GH患者联合服用免疫调节剂后的疗效。方法以人单纯疱疹病毒(HSV)-2Sav感染从未感染过HSV的雌性中华彩豚，建成GH豚鼠模型，待其症状好转后，通过聚合酶链反应(PCR)检测豚鼠外生殖器及生殖道拭子HSV-DNA的阳性率，酶联免疫吸附试验（ELISA）测出其血清白细胞介素(IL)-2、IL-4的浓度，再分别与空白对照组及用药组比较。结果亚临床型GH豚鼠模型仍有HSV排泌，且其IL-2浓度显著低于空白对照组（P ＜0.01），而IL-4浓度高于空白对照组（P ＜0.05）；用药组的豚鼠HSV-DNA阳性率明显减少，而其血清IL-2浓度高于亚临床GH豚鼠模型组，IL-4的水平低于亚临床GH豚鼠模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论亚临床型GH豚鼠模型确实存在HSV排泌，同时其血清中细胞因子的分泌也发生了异常，匹多莫德联合铜绿假单胞菌注射液治疗后不仅能减少HSV排泌，还能改善机体免疫失衡状态。

生殖器疱疹，亚临床型；匹多莫德；铜绿假单胞菌；单纯疱疹病毒；白细胞介素

亚临床型生殖器疱疹（GH）也即无症状病毒携带，是指缺乏典型的症状（如簇集性水疱、脓疱、裂隙、糜烂、溃疡等皮损）及体征，但仍能在患者的外生殖器、宫颈或肛周等部位检测到单纯疱疹病毒(HSV)的一种特殊的生殖器疱疹临床类型。易被门诊医生及患者忽视，导致HSV在性伴之间广泛传播[1]。HSV属α疱疹病毒科，其感染的一个主要特点就是能够在宿主体内潜伏感染[2]。HSV-1易潜伏于三叉神经节，而HSV-2易潜伏于骶尾神经节，当患者机体免疫功能下降可再次使HSV被激活而使病情反复。这也可能是GH发病率居高不下的根本原因。因此减少亚临床型GH患者HSV排泌[3]，以及纠正机体免疫紊乱[4]状况是治疗和预防GH最重要的一环。探寻出一种减少和控制GH患者HSV排泌同时又能改善免疫功能的治疗方案具有重要意义。本项目在HSV核酸及细胞因子生物检测水平进行研究，以探索治疗人类亚临床型GH的有效方法。

1　材料与方法

1.1材料

雌性中华彩豚（桂林医学院中心实验室提供），重量约250（±20）g[5]。用于GH模型的HSV-2Sav株从中国疾病预防控制中心病毒所引进。豚鼠白细胞介素(IL)-2酶联免疫试剂盒（产品编号CSB-E12914Gp）、豚鼠IL-4酶联免疫试剂盒（产品编号CSB-E10126Gu）均由武汉华美生物工程有限公司（CUSABIO）提供。匹多莫德片（万适宁）由太阳石药业生产。铜绿假单胞菌注射液（MSHA菌毛株，批准文号：国药准字S20043022），由北京万特尔生物制药有限公司生产。离心机（中大仪器 TGL-16），培养箱（精宏仪器GNP-9270，酶标仪（Thermo MK-3）。HSV核酸检测试剂盒（HSV-2型）及MJ2型荧光聚合酶链反应（PCR）检测仪均由深圳市匹基生物工程股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分组随机选用已排除HSV感染的雌性中华彩豚，共36只，采用数字表法随机选取10只设为空白对照组，其余均建成GH豚鼠模型，待GH症状好转后（约16 d后GH豚鼠模型外生殖器部位无典型皮损），随机选取11只为亚临床型GH豚鼠模型组，余下10只为用药组，再通过PCR定性检测各组豚鼠外生殖器及宫颈拭子HSV-DNA的阳性率及用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定出各组豚鼠机体血清IL-2、IL-4的浓度（pg/ml），其中5只死于继发感染。

1.2.2入选条件 有皮损的GH豚鼠模型好转后外生殖器部位已无典型GH的症状。

1.2.3建模GH豚鼠模型的制作[5]：建模前一天晚上豚鼠停止饮水，建模时先用无菌棉签蘸取适量生理盐水清洗豚鼠外阴，用七星针轻叩会阴部数次至有少许出血，继之用1 ml注射器吸取0.1 ml HSV-2Sav病毒液配上灌胃针头伸入豚鼠阴道内约3～4 cm，将病毒液注入阴道穹隆处后缓慢退出，再用明胶海绵置入阴道口，防止病毒液溢出。

1.2.4免疫调节剂的使用建立GH豚鼠模型后约第16天（原发皮损消退），再分为亚临床型GH豚鼠模型组（不给药）及用药组；用药组给药方法为每日饲喂匹多莫德1/2片，铜绿假单胞菌注射液按每只1 ml，每30天于皮下注射1次。

1.2.5 HSV-DNA检测及ELISA测定亚临床型豚鼠模型组和用药90 d后的用药组豚鼠在灌胃针帮助下用无菌棉拭子在宫颈上皮、尿道口、阴道黏膜及外生殖器患过皮损部位取材，再采用新型HSV-DNA检测试剂盒（HSV-2型）及MJ2型荧光PCR检测仪分别检测亚临床型GH豚鼠模型组及用药组豚鼠HSVDNA的阳性率。后将空白对照组、亚临床型GH豚鼠模型组及已联合用药90 d的用药组豚鼠用3.5%水合氯醛溶液按350 ml/kg腹腔注射麻醉后心脏取血，离心（2 500 r/min，8 ℃）分离出血清，继之用双抗体夹心ELISA法分别测定出各组豚鼠血清IL-2及IL-4的浓度（pg/ml）。

1.3统计学方法

使用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，HSVDNA检测阳性率用两独立样本的卡方检验，而各组豚鼠IL-2、IL-4的浓度均为计量资料符合正态分布（P＞0.1），方差齐（P ＞0.1），采用方差分析，数据用均值±标准差（x¯ ±s）描述。P ≤ 0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HSV的排泌情况

11只亚临床型GH模型组的豚鼠，HSV排泌阳性7只（63.6%），而10只联合使用匹多莫德片及铜绿假单胞菌注射液治疗的豚鼠，HSV排泌阳性仅有1只（表1）。

表1　两组豚鼠HSV-DNA检测阳性率 [只(%)]

2.2各组血清IL-2和IL-4的水平

亚临床型GH模型组的豚鼠血清IL-2的浓度显著低于空白对照组（P＜0.01），而其血清IL-4浓度高于空白对照组（P＜0.05），联合使用匹多莫德片及铜绿假单胞菌注射液治疗组的豚鼠血清IL-2浓度高于亚临床型GH模型组（P＜0.05），而IL-4浓度低于亚临床型GH模型组，两组相比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组与用药组豚鼠血清IL-2、IL-4的浓度相比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2　各组血清IL-2和IL-4水平检测结果 （x¯ ±s）

3　讨论

亚临床型GH是皮肤与性病科门诊易被忽略的一种特殊类型的性传播疾病[6]，而GH患病70%是通过无症状的GH患者进行传染，因此其危害不容小觑。细胞因子IL-2主要是由Th1细胞分泌的，主要介导细胞免疫[7]；而IL-4是由Th2细胞分泌的，主要介导体液免疫。以上实验表明，亚临床型GH豚鼠模型不仅有HSV的排泌还存在细胞免疫及体液免疫功能不平衡的状况。11只亚临床型GH模型组的豚鼠HSV-DNA阳性有7只(63.6%)，而10只用药组的豚鼠HSV-DNA阳性仅有1只(10%)；亚临床型GH豚鼠模型组的IL-2的水平明显低于空白对照组（P＜0.01），而其血清IL-4的水平高于空白对照组（P＜0.05），用药组的豚鼠IL-2的水平高于亚临床型GH豚鼠模型组（P＜0.05），而IL-4浓度低于亚临床型GH模型组（P＜0.05），用药组与空白对照组的豚鼠IL-2、IL-4的水平相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可知亚临床型豚鼠模型同样存在Th1/Th2平衡失调（即Th1向Th2漂移）[8]，联合使用匹多莫德及铜绿假单胞菌注射液治疗后不仅能够使亚临床型GH豚鼠模型HSV的排泌得到控制，还能通过上调IL-2浓度和下调IL-4浓度来改善细胞免疫及体液免疫失衡状态。铜绿假单胞菌注射液（PAMSHA）[9]是一种具有广泛的免疫调节作用和较强的免疫刺激活性的制剂，其可以促进Th1细胞因子干扰素（IFN）-γ、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-β等的分泌，从而增强机体的细胞免疫，还可以间接活化自然杀伤（NK）细胞[10]，以增强机体防御的能力。匹多莫德亦是一种新型的、人工合成的免疫调节剂[11]，可刺激机体的特异性免疫应答及非特异性免疫应答[12]，能双向高效调节机体细胞及体液免疫不平衡状态,进而间接促使机体发挥抗病毒作用。因此联合使用匹多莫德及铜绿假单胞菌注射液既能够加强抗病毒作用又能够调控机体的免疫功能，而且长期应用后未见明显不良反应，因此值得临床应用。

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（本文编辑耿建丽）

The influence of combined application of immunomodulator on the asymptomatic shedding and serum IL-2, IL-4 levels of subclinical GH guinea pig model

WANG Li-ping，LU Fu-yong，WEI Jiao，et al
Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Giulin Medical University, Giulin 541001, China

ObjectiveTo observe the detoxification and immunity status of subclinical genital herpes(GH) guinea pig model which accepted combined treatment of pidotimod tablets and pseudomonas aeruginosa injection, so as to reveal the effect of administration of immunomodulator in patients with subclinical GH. MethodsGH guinea pig model was gained by using HSV-2 sav to infect female guinea pig which had never been infected by HSV, polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the HSV-DNA of guinea pig genital and genital tract swab, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to detect the concentration of serum IL-2 and IL-4(pg/ml). Finally the data of the different groups were analyzed and compared. ResultsGuinea pigs model of subclinical GH shedding HSV was confirmed, and the serum IL-2 levels of subclinical GH guinea pig model group was significantly lower than that of blank control group (P＜0.01), IL-4 levels of subclinical GH guinea pigs model group was higher than that of blank control group (P＜0.05). The HSV-DNA positive rate of medication group decreased significantly, and the serum IL-2 levels of medication group was higher than that of subclinical GH guinea pigs model group, the serum IL-4 levels of medication group was lower than that of subclinical GH guinea pigs model group, and the difference was statistically significant (P＜0.05). ConclusionThe guinea pig model of subclinical GH shedding HSV was confirmed and the secretion of serum cytokine became abnormality. Combined application of pidotimod and pseudomonas aeruginosa injection can reduce HSV shedding and improve immune imbalance.

Herpes genital，subclinical；Pidotimod；Pseudomonas aeruginosa；HSV；IL [J Pract Dermatol, 2016, 9(1):12-14]

R752.11

A

1674-1293(2016)01-0012-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160104

广西自然科学基金资助项目（2013GXNSFAA019206）；桂林科技局公关项目（2013012010）

541001 桂林，桂林医学院附属医院皮肤与性病科（王利平，魏娇，杨凤元，蒙坚，罗婧莹，程培华）；南溪山医院皮肤科（陆富永）

王利平，医师，研究方向：生殖器疱疹，

E-mail: 646053871@qq.com

程培华，E-mail: phchengg@163.com

（2015-08-05

2015-10-20）