石斛合剂对胰岛素抵抗肝细胞模型的影响

林心君，郑远燕，张捷平，刘言凤，施红

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122；2.泉州市丰泽区东海街道社区医院，福建泉州362400）

石斛合剂对胰岛素抵抗肝细胞模型的影响

林心君1，郑远燕2，张捷平1，刘言凤1，施红1

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122；2.泉州市丰泽区东海街道社区医院，福建泉州362400）

目的初步探讨石斛合剂对胰岛素抵抗（IR）肝细胞模型的影响，旨在阐明石斛合剂改善IR的作用及机制。方法采用实验筛选的胰岛素造模浓度培养LO2细胞24 h，建立IR肝细胞模型。以空白血清和石斛合剂含药血清（浓度由实验筛选出）干预正常肝细胞和IR肝细胞，葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GLU-GOD）法检测培养液中残存葡萄糖水平，计算胰岛素敏感指数；并检测加PI3K抑制剂后石斛合剂对IR肝细胞胰岛素敏感指数的影响。结果由实验筛选出的造模胰岛素浓度为5×10-5mol／L，石斛合剂含药血清和空白血清浓度为2.5%；含药血清模型组胰岛素敏感指数虽低于正常肝细胞组（P＜0.05），但与IR肝细胞组比较则显著提高（P＜0.05）；与IR肝细胞组比较，加抑制剂后各组细胞的胰岛素敏感指数均明显下降（P＜0.05）。结论中药复方石斛合剂可改善IR肝细胞的胰岛素敏感指数，减轻胰岛素抵抗，可能部分通过PI3K信号途径起效。

胰岛素抵抗肝细胞；胰岛素敏感指数；石斛合剂

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是指胰岛素作用的靶器官（如肝脏、骨骼肌、脂肪组织）对胰岛素作用的敏感性下降的一种病理现象，是糖尿病、肥胖等代谢性疾病的共同土壤［1-2］，因此改善IR的研究具有重要的临床意义。研究表明：中医药通过多途径、多环节、多靶点发挥作用，许多单味中药及复方制剂都具有降低胰高血糖素、增加葡萄糖摄取和利用、刺激胰岛素分泌、调节血脂等作用［3-6］。本课题组从1995至今的石斛合剂系列研究证明：具有滋阴益气活血功效的石斛合剂（现为福建省二人民医院院内制剂，专利申请号：201110408411.0），不仅可明显改善患者临床症状，降低糖化血红蛋白，综合疗效优于二甲双胍、参麦散、玉液汤等，而且还能增加胰岛素受体的表达，促进HepG2细胞的糖代谢［7-10］。本实验旨在通过建立IR肝细胞模型，在细胞水平上观察该方对高胰岛素诱发IR的影响，以初步探讨其改善IR的作用及机制。

1材料

1.1 实验仪器倒置相差显微镜［IX70，日本OLYMPUS公司］；酶标仪（ELx800，美国Bio-TEK公司）；细胞培养箱（HF212UV，美国Thermo Forma公司）。

1.2 药品与试剂中药复方石斛合剂（石斛、黄芪、知母、丹参、五味子、葛根等）购自福建中医药大学国医堂；RPMI1640培养液、胎牛血清、溴化-（4，5-二甲-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）购自Genview公司；PI3K抑制剂购自碧云天生物技术研究所；未提及试剂均购自美国Sigma公司。

1.3 细胞及动物来源人肝细胞株（LO2）购于上海细胞所；SPF级Wistar大鼠，雄性，体质量190～230 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：2007000546931。

2方法

2.1 LO2细胞的培养LO2细胞用含10%胎牛血清的培养基，在37℃、5%CO2环境培养、传代。

2.2 石斛合剂含药血清的制备参照课题组前期研究［10］。

2.3 筛选含药血清浓度

2.3.1 LO2细胞存活率取对数生长期的LO2细胞，3×103／m L接种于96孔板，待细胞长至80%，先以不同浓度的含药血清和空白血清（见表1）孵育12 h、24 h、48 h，再加入5 mg／mL的MTT溶液20 μL，避光培养4 h，弃上清，酶标仪测定吸光度（OD），筛选最佳含药血清浓度。

2.3.2 细胞形态学观察同样方法培养LO2细胞，加入由上述实验中筛选出的的含药血清和空白血清浓度，24 h后去上清，PBS洗2遍，10%甲醛固定，Giemsa染色法观察镜下细胞形态。

2.4 筛选造模胰岛素浓度取对数生长期LO2细胞，按106／瓶接种于培养瓶，待细胞贴壁后去旧培养基，分别加入不含胰岛素的全培液（对照组）和不同浓度（5×10-4mol／L、5×10-5mol／L、5×10-6mol／L）的胰岛素全培液24 h后，消化，重悬，每组按3× 105／管分装，离心，去上清，加入含3.5×10-5mol／L胰岛素的无酚红培养液，37℃温育3 h后取上清，GOD-POD法测定各组（对照组、5×10-6mol／L胰岛

素组、5×10-5mol／L胰岛素组、5×10-4mol／L胰岛素组）的残存葡萄糖浓度。

2.5 筛选胰岛素的刺激浓度同样方法培养LO2细胞，按3×105／管分装15管，离心，去上清，分别加入含7×10-5mol／L、3.5×10-5mol／L、1.75×10-5mol／L、0.875×10-5mol／L、0 mol／L（对照组）胰岛素的无酚红培养液，孵育后，取上清，GOD-POD法测定残存葡萄糖浓度。

2.6 石斛合剂对IR肝细胞胰岛素敏感性指数的影响将肝细胞分6组：正常对照组（正常肝细胞）为A1组，模型对照组（IR肝细胞）为B1组，正常肝细胞+空白血清组为C1组，IR肝细胞+空白血清组为D1组，正常肝细胞+含药血清组为E1组，IR肝细胞+含药血清组为F1组。正常肝细胞相关组（B1、D1、F1组）予含5×10-5mol／L胰岛素的全培液，IR肝细胞相关组（A1、C1、E1组）予全培液，孵育24 h后，取上清，C1、D1组加空白血清，E1、F1组加含药血清，24 h后测定残存葡萄糖浓度，并计算胰岛素敏感性指数［11］。

2.7 加PI3K抑制剂（30 nmol／L）后石斛合剂对IR肝细胞模型岛素敏感指数的影响将肝细胞分6组：正常对照组（正常肝细胞）为A2组，模型对照组（IR肝细胞）为B2组，正常肝细胞+PI3K抑制剂组为C2组，IR肝细胞+PI3K抑制剂组为D2组，正常肝细胞+含药血清+PI3K抑制剂组为E2组，IR肝细胞+含药血清+PI3K抑制剂组为F2组，按上述方法造模、加药、测定培养液中残存葡萄糖浓度并计算胰岛素敏感指数。

2.8 统计学处理采用SPSS17.0软件处理数据。计量资料采用t检验，多个样本均数的比较采用方差分析。

3结果

3.1 不同浓度含药血清和空白血清对LO2细胞存活率的影响见表1。

表1 不同浓度含药血清和空白血清对LO 2细胞存活率的影响（x±s）

3.2 2.5%空白血清组及含药血清组细胞形态学观察见图1。由图1看出2.5%空白血清组及含药血清组的细胞胞核、胞质、胞膜结构完整、清晰，与正常组比较，细胞形态无明显差异，说明2.5%含药血清及空白血清无明显细胞毒性。

3.3 造模用胰岛素浓度筛选见图2。

3.4 刺激量胰岛素浓度筛选见图3。

3.5 石斛合剂含药血清对各组细胞胰岛素敏感指数影响见表2。

表2 石斛合剂含药血清对各组细胞胰岛素敏感指数影响（x±s）

3.6 PI3K抑制剂对各组细胞胰岛素敏感指数影响见表3。

表3 PI3K抑制剂对各组细胞胰岛素敏感指数影响（x±s）

4讨论

4.1 肝细胞胰岛素抵抗模型IR是代谢综合征的核心表现，关于IR研究日益被人们所重视，而探索稳定而有效的IR细胞模型成为IR相关疾病研究的关键问题，也是在细胞水平上深入研究IR发生机制的基础。目前比较常用的IR细胞模型有：高葡萄糖诱导培养模型、高胰岛素诱导培养模型、高类固醇诱导培养模型等，其中以较稳定的高胰岛素诱导培养模型的使用最为广泛［12－13］。肝脏是胰岛素发挥效应的重要靶器官，也是胰岛素受体分布最密集脏器之一，故本实验采用LO2肝细胞株加高胰岛素诱导培养法建立IR模型。

本实验筛选出2.5%（无毒浓度）为含药血清及空白血清浓度，最小有效浓度5×10-5mol／L为造模用胰岛素浓度，与文献［14］报道的浓度有别，考虑可能与实验条件的差异以及选用的肝细胞株不同有关。3.5×10-5mol／L及7×10-5mol／L这两种浓度的胰岛素都能增加胰岛素抵抗肝细胞的葡萄糖摄取，选用最小有效刺激浓度3.5×10-5mol／L。实验中选用最小有效的造模浓度和胰岛素刺激浓度，旨在尽可能减少高胰岛素对细胞的毒性。

4.2 石斛合剂对IR肝细胞模型胰岛素敏感指数的影响糖尿病属于祖国医学“消渴病”的范畴，是IR的代表性疾病，故医家多从“消渴病”的角度认识IR［15］，认为其病位主要在肝、脾、肾三脏，以气、阴、阳虚为本，痰浊、瘀血、热毒为标。石斛合剂具有滋阴清热、益气活血的功效。本实验用石斛合剂含药血清干预IR肝细胞模型，结果显示：石斛合剂含药血清能提高胰岛素敏感性指数，改善IR；加入PI3K抑制剂后石斛合剂改善IR的作用消失，说明PI3K抑制剂能减弱甚至阻断石斛合剂改善IR的作用，提示石斛合剂可能通过PI3K通路改善IR。此作用是直接作用PI3K通路，还是继发效应还有待进一步深入研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0040-03

2016－05－10

福建省卫生厅科技创新项目（2014-CX-29）；福建省教育厅重点项目（JA15228）

林心君（1979—），女，讲师，博士研究生，研究方向：中西医结合治疗糖尿病研究。

施红，女，教授，博士生导师。E-mail：shihong3327@sina.com