先天性巨结肠病变肠段CAD、S-100蛋白表达及其临床意义

符策君，张小波，李权

(海南省人民医院，海口570311)



先天性巨结肠病变肠段CAD、S-100蛋白表达及其临床意义

符策君，张小波，李权

(海南省人民医院，海口570311)

目的 探讨组织蛋白酶D(CAD)、S-100蛋白在先天性巨结肠(HD)发生、发展中的作用及其作用机制。方法 选择HD患儿41例(HD组)，分别取病变肠段的狭窄段、移行段、扩张段；另取10例因肠穿孔或肠梗阻行结肠造瘘术患儿的病变结肠组织(对照组)。免疫组化染色后，观察两组病变肠段CAD、S-100蛋白阳性表达，并比较两组肌间神经从、成熟神经节细胞数量。结果 HD组狭窄段和移行段CAD阳性表达率明显低于对照组，移行段和扩张段S-100蛋白阳性表达率明显低于对照组(P均<0.05)。对照组神经纤维、神经胶质细胞可见S-100蛋白阳性表达，而神经节细胞未见S-100蛋白阳性表达；神经节细胞可见CAD阳性表达，细胞形态规则，核仁明显；另有少量细胞形态不规则，缺乏核仁。HD组各段肌间神经丛、成熟神经节细胞数明显低于对照组(P均<0.05)。结论 CAD、S-100蛋白表达降低可促进HD的发生、发展；其机制可能与病变肠段神经节及间质神经纤维数量减少有关。

先天性巨结肠；组织蛋白酶D；S-100蛋白

先天性巨结肠(HD)是由于结肠黏膜及黏膜下括约肌神经丛缺乏神经节细胞或神经节细胞功能减退，导致肠管持续痉挛，粪便淤滞于近端结肠，继而近端结肠肥厚、扩张，是小儿常见的先天性肠道疾病之一[1，2]。其病因及发病机制目前尚未完全清楚[3]。一般认为，细胞外基质异常表达及神经节脊细胞的无功能迁移可能是导致HD的主要原因。有研究发现，组织蛋白酶D(CAD)和S-100蛋白可诱导细胞外基质的分化不良，导致神经节细胞的功能异常[4]。本研究探讨CAD和S-100蛋白在HD发生、发展中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2007年2月～2015年5月我院收治的HD患儿41例(HD组)，男28例、女13例，年龄5个月～4岁、平均1.52岁，体质量4.5～18.7 kg、平均11.8 kg，身高51.4～120.6 cm、平均71.3 cm，均为足月儿。均经X线钡灌肠、直肠黏膜活检等检查明确诊断。排除合并其他消化道畸形。41例患儿均行巨结肠根治术。术中每例患儿切除肠管17～31 cm、平均25.0 cm，其中狭窄段平均10.24 cm、移行段平均5.01 cm、扩张段平均7.82 cm。对照组为10例同期因肠穿孔或肠梗阻行结肠造瘘术患儿，男7例、女3例，年龄5个月～4岁、平均1.47岁，体质量4.7～17.9 kg、平均11.6 kg，身高51.3～118.6 cm、平均73.1 cm，均为足月儿。术中取其病变结肠组织。两组性别、年龄、体质量、身高等具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患儿家属均知情同意。

1.2 相关指标观察

1.2.1 病变结肠组织CAD、S-100蛋白表达 采用免疫组化染色法。取两组手术切除的结肠组织标本(HD组分别取狭窄段、移行段、扩张段肠组织)，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片。石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲新，PBS浸泡5 min，3% H2O2室温孵育5 min，去离子水冲洗3 min×3次；10%牛奶蛋白(1 g蛋白+100 mL纯水)封闭，室温孵育5 min，滴加CAD或S-100蛋白抗体(鼠来源)，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗5 min×3次；滴加HRP标记的二抗(兔来源)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次；滴加NBT/BCIP显色剂显色5 min，复染，脱水，透明，封片，显微镜下拍照观察。结果判定：CAD阳性染色定位于神经节细胞胞质，呈棕黄色颗粒。S-100蛋白阳性染色定位于神经纤维细胞，呈棕黄色颗粒。随机取一张切片，低倍镜(×100)下计数阳性染色细胞及细胞总数，阳性细胞所占比例<25%为阴性，≥25%～<50%为弱阳性，≥50%～<75%为阳性，≥75%为强阳性。阳性细胞所占比例≥25%即为阳性表达。

1.2.2 肠壁肌间神经丛及成熟神经节细胞数量 每张S-100蛋白染色切片于低倍镜(×100)下随机选取10个视野，观察肌间神经丛数。每张CAD染色切片于高倍镜(×400)下随机选取20个肌间神经丛，观察丛内神经节细胞数，区分成熟和未成熟神经节细胞(细胞形态规则、有明显核仁即可判断为成熟神经节细胞)。

2 结果

2.1 两组结肠组织CAD、S-100蛋白阳性表达比较 见表1。对照组神经纤维、神经胶质细胞S-100蛋白阳性表达，而神经节细胞未见S-100蛋白阳性表达，黏膜下、肌间可有大量深染的神经丛，尤以肌间最多，丛内有典型的细胞状“空白”区。神经节细胞CAD阳性表达，细胞形态规则，核仁明显，胞质内见棕黄色颗粒，另有少量阳性细胞形态不规则，核仁不明显。HD组狭窄段神经纤维、神经胶质细胞S-100蛋白阳性表达，镜下可见神经纤维细胞肥大，染色呈深褐色，神经丛内缺乏典型的细胞状“空白”区；HD组移行段神经纤维细胞增粗，染色相对较浅，偶可见神经丛内细胞状“空白”区，但多不典型；HD组扩张段神经纤维细胞形态逐渐恢复正常，染色浅，镜下可见典型的细胞状“空白”区。HD组狭窄段肌间神经丛内神经节细胞缺失，未见CAD阳性表达细胞；HD组移行段可见少量CAD阳性表达细胞，多位于黏膜下神经丛内，多数细胞形态偏小、无核仁；HD组扩张段镜下可见正常肠壁结构，神经丛内神经节细胞胞质呈阳性反应，CAD阳性细胞形态规则、核仁明显。

表1 两组CAD、S-100蛋白阳性表达比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组肠壁肌间神经丛及成熟神经节细胞数量比较 见表2。

表2 两组肠壁肌间神经丛及成熟神经节细胞数量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

HD为一组良性增生性疾病，可导致患儿出现顽固性腹胀、便秘以及肠道营养吸收障碍引起的营养不良性发育迟缓，部分患儿可因肠液大量聚集、肠道正常菌群失调以及部分微生物分泌的细胞外毒素侵袭肠壁，可伴发小肠结肠炎[4]。Swenson或Soave手术为HD的常用术式且疗效较好。但杨小进等[5]研究发现，约25%的患儿术后仍然出现明显的便秘或腹泻症状。尚卿等[6]研究认为，部分HD病灶的残留及其对周边正常肠道黏膜下神经丛神经节的慢性侵袭性影响可能是导致其临床症状复发的原因。

CAD主要表达于脑、脊髓等部分神经元细胞，其在神经节细胞核周边及胞质内的聚集程度可影响神经节细胞的分化成熟程度[7]。S-100蛋白的天冬氨酸残基末端磷酸化可影响肠道自主神经节的电冲动传递。二者可能参与HD的发生、发展，同时其异常表达可为HD诊断提供一定参考。此外，S-100蛋白还可诱导肠道黏膜皱襞中神经节细胞的缺失。有研究证实，在炎症、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等组织中CAD、S-100异常表达，并与患者远期预后有一定关系[8]。但二者在HD中的研究目前相对较少，且相关研究的样本量较少、临床资料偏移较为严重。

本研究结果显示，HD组狭窄段和移行段CAD阳性表达率明显低于对照组，表明CAD低表达可促进HD的发生、发展；原因可能为CAD表达降低失去了对神经节鞘膜细胞在分化、成熟中保护作用。HD组移行段和扩张段S-100蛋白阳性表达率明显低于对照组，提示S-100蛋白低表达在促进HD发生过程中可能具有一定作用。但本研究并未发现HD组狭窄段S-100蛋白阳性表达与对照组的差异，可能与样本量不足、临床资料纳入及检测方法不统一等有关。本研究还发现，对照组S-100蛋白阳性表达于神经纤维、神经胶质细胞，黏膜下、肌间可有大量深染的神经丛，尤以肌间最多，丛内有典型的细胞状“空白”区；而神经节细胞可见CAD阳性表达，呈棕黄色颗粒，二者阳性表达定位不同可用于区分神经节细胞和神经纤维细胞[9，10]。进一步分析发现，HD组病变肠段神经纤维细胞肥大，染色呈深褐色，神经丛内缺乏典型的细胞状“空白”区，提示神经节细胞缺乏的同时往往伴随明显的神经纤维增粗等代偿性改变。HD组各段肌间神经丛、成熟神经节细胞数明显低于对照组，表明成熟神经节或神经丛的数目异常可能是导致HD发生的核心因素，但仍需进一步研究证实。提示临床手术过程中扩大HD病变肠段切除范围能减少术后便秘或腹泻的发生[11～16]。

综上所述，CAD、S-100蛋白表达降低可促进HD的发生、发展；其机制可能与病变肠段神经节及间质神经纤维数量减少有关。

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