PNPLA3基因I148M多态性对肝癌细胞HepG2细胞周期及Cyclin D1、p53表达的影响

韩利蓉，宋江勤，郭飞波

(天门市第一人民医院，湖北天门431700)



PNPLA3基因I148M多态性对肝癌细胞HepG2细胞周期及Cyclin D1、p53表达的影响

韩利蓉，宋江勤，郭飞波

(天门市第一人民医院，湖北天门431700)

目的 探讨含patatin样磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因I148M多态性对肝癌细胞HepG2细胞周期及Cyclin D1、p53表达的影响。方法 构建PNPLA3基因I148M突变型(突变组)、PNPLA3基因I148M野生型(野生组)的肝癌细胞HepG2，以空载体细胞作为对照组，采用流式细胞仪检测各组细胞周期，Western blotting、荧光定量PCR技术检测各组细胞Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表达。结果 突变组G1期细胞所占比例明显低于野生组和对照组，S、G2/M期细胞所占比例明显高于野生组和对照组(P均<0.05)；野生组与对照组G1、S、G2/M期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。三组间Cyclin D1蛋白及mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，突变组p53蛋白及mRNA相对表达量显著高于野生组和对照组(P均<0.05)，而野生组和对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 PNPLA3基因I148M多态性能够诱导p53过表达，导致肝细胞周期紊乱，最终发展成肝癌细胞。

肝癌；含patatin样磷脂酶域蛋白3；基因多态性；细胞周期；细胞周期蛋白D1；p53

国内外研究均证实，细胞周期阻滞与肿瘤的发生、发展密切相关[1，2]。含patatin样磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)属于PNPLA家族成员之一，与传统激素敏感性脂肪酶相比，PNPLA家族成员N末端均有一个patatin区域，使得其在体内外均具有脂肪合成和分解功能，被认为是调节肝脏脂肪代谢的主要基因之一[3～6]。Rametta等[7]对人类染色体上PNPLA3基因分析发现，I148M多态性位点与肝脏脂肪含量升高有关。Hoekstra等[8]研究亦证实，PNPLA3基因I148M多态性与肝纤维化有关，且是肝癌发生的独立危险因素。由于脂肪代谢紊乱是多种肝病甚至肝癌的发病基础，推测PNPLA3基因I148M多态性可能与肝癌的发生、发展有关。2014年7月～2015年4月，我们观察了PNPLA3基因I148M多态性对人肝癌细胞HepG2细胞周期及Cyclin D1、p53表达的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2和PNPLA3基因I148M突变型、PNPLA3基因I148M野生型、空载质粒转染的腺病毒，均购自上海士锋生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，购自美国赛默飞世尔科技公司；蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、SDS-PAGE电泳分离蛋白均购自武汉博士德生物工程有限公司；β-actin抗体、辣根过氧化酶标记的二抗(羊抗鼠IgG抗体)、Cyclin D1单克隆抗体、p53单克隆抗体均购自美国圣克鲁斯生物技术公司；Cyclin D1、p53、β-actin引物由美国金斯瑞生物科技有限公司设计。ABI GeneAmp 9700 PCR仪、Odyssey成像系统及图像分析软件购自美国LI-COR公司。

1.2 细胞培养及腺病毒转染 取人肝癌细胞株HepG2置于DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养。培养3天，待细胞融合≥80%时，加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL消化，吸弃旧培养液，PBS洗涤3次，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，混匀后加入新鲜培养基传代培养。取第4代对数生长期HepG2细胞，接种于6孔板中，每孔约2×105个，每孔设3个复孔。胰蛋白酶-EDTA消化后，加入RPMI 1640培养液，CO2培养箱中孵育12 h，分别加入含有PNPLA3基因I148M突变型腺病毒(突变组)、PNPLA3基因I148M野生型腺病毒(野生组)和空载质粒转染的腺病毒(对照组)3×107IU。转染24 h，加入聚凝胺使培养体系终浓度为6 mg/L，继续培养48 h，倒置荧光显微镜下观察并计算细胞转染效率。以倒置荧光显微镜下发现绿色荧光作为转染成功的标志。

1.3 细胞周期检测 取对数生长期HepG2细胞，PBS冲洗2次，移液枪吹打成细胞悬液并置于离心管中，室温下1 000 r/min离心10 min，PBS冲洗5 min×3次；滴加中性乙醇1 mL，4 ℃固定过夜。24 h后，室温下1 000 r/min离心10 min，PBS冲洗5 min×3次，吹打或细胞成悬液，加入适量碘化丙啶(PI，预先用PBS配制成1 mg/mL)和RNase，使其终浓度为50 mg/L，置于水浴锅上37 ℃温浴45 min。采用流式细胞仪检测细胞周期，每次5×104个细胞。重复检测3次，取平均值。

1.4 PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白检测 采用Western blotting技术。取对数生长期HepG2细胞，接种于6孔板，每孔加入含1% PMSF的细胞裂解液100 μL，待细胞完全裂解后，15 000 r/min离心5 min，留取上清液。将上清液移至EP管中，加入等量上样液，100 ℃煮沸5 min，使蛋白完全变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白，并转移至PVDF膜上，100 mA、40 min电转后将PVDF膜取出。5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶2 000稀释的PNPLA3单克隆抗体、1∶1 000稀释的Cyclin D1单克隆抗体和1∶500稀释的p53单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，加入1∶10 000稀释的二抗，室温下震荡3 h，PBS冲洗3次；荧光图像扫描及条带灰度值分析。PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白相对表对量为样本条带与β-actin条带灰度值之比。

1.5 PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA检测 采用荧光定量PCR技术。取对数生长期HepG2细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并逆转录成cDNA。PCR扩增：PNPLA3上游引物：5′-CGGAAGACTGTGTCGAGCAA-3′，下游引物：5′-GGATCAAGCGCACTGTGGA-3′；Cyclin D1上游引物：5′-CCGTGTGCTAGCATAGCGC-3′，下游引物：5′-TGCTGGTCAATGTGGCTA-3′；p53上游引物： 5′-GACGTT-

CGGTGTCAGTCTGCC-3′，下游引物：5′-TGGCTGCGACTACATTAGGAC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGCATGCTCGGCTGCGTCT-3′，下游引物：5′-GGTCTGAGGTTCAGCGTTGC-3′。PNPLA3扩增条件：96 ℃预变性1 min，95 ℃变性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环后72 ℃延伸10 min；Cyclin D1扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环后72 ℃延伸5 min。p53扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环后72 ℃延伸5 min。记录各检测指标的CT值，重复检测3次，取平均值。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 腺病毒转染HepG2细胞情况 携带不同基因型的腺病毒转染HepG2细胞48 h，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白阳性表达率均高达90%，说明表达目的基因的细胞株构建成功。见插页Ⅲ图9。

2.2 各组细胞周期分布比较 见表1。

表1 各组细胞周期分布比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与野生组比较，#P<0.05。

2.3 各组PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表达比较 见表2。

表2 各组PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与野生组比较，#P<0.05。

3 讨论

PNPLA3基因属于patatin样磷脂酶家族成员，具有非特异性水解酶的活性。PNPLA3基因多态性与人类非酒精性脂肪肝的遗传易感性密切相关。近年研究显示，PNPLA3基因多态性与多种肝脏疾病密切相关，其中I148M位点的多态性与肝脏脂肪含量显著升高有关[9]。由于这种脂肪升高不受遗传、体质量、原发病和乙醇摄入的影响，故有学者认为PNPLA3基因I148M多态性可能是导致肝脏病变的主要原因[10]。国外研究证实，PNPLA3基因I148M多态性不仅会增加肝脏脂肪含量，而且与肝脏组织学病变有关[11]。Pirazzi等[12]研究发现，PNPLA3基因I148M多态性与肝纤维化有关，并可能参与了肝细胞癌的发生。关于PNPLA3基因I148M多态性诱导肝脏病变的机制目前尚不清楚，但可以肯定的是与脂肪代谢有关。Burza等[13]研究发现，PNPLA3蛋白能够水解TG，其I148M位点多态性会导致水解酶的活性丧失，证实I148M多态性可能通过抑制PNPLA3的活性而导致TG分解受阻，而TG蓄积极易导致肝脏脂肪含量增加。对PNPLA3蛋白三维结构解析发现，其148位点氨基酸更换并未改变活性中心和空间结构，而是蛋氨酸的侧臂遮盖了活性中心与底物的结构，从而导致酶对TG水解活性降低[14]。但Valenti等[15]对小鼠PNPLA3基因敲除后并未获得小鼠脂肪肝模型，也未对小鼠体内TG的代谢造成影响。上述研究结果均提示PNPLA3基因I148M多态性对肝脏病变的影响作用机制较为复杂，需要深入研究。

细胞周期紊乱会导致细胞能量和物质代谢异常，最终引起细胞恶变[16，17]。Romeo等[18]认为，肝癌细胞周期明显异常，铂类等抗肿瘤药物的主要作用机制就是改变肿瘤细胞周期，诱导细胞发生凋亡。细胞周期主要有G1、S、G2、M期，其中G1/S期和G2/M期在维持细胞周期运转方面最为重要。当细胞通过G1/S期和G2/M期后，则无需依赖外界的分裂信号，能独立完成细胞周期[19]。因此G1/S期和G2/M期被认为是调控细胞周期的关键时期。Cyclin D1、p53均属于细胞周期调节蛋白，Cyclin D1是由人类CCND1基因所编码的一类蛋白质，其可通过结合并激活G1期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4，磷酸化G1期周期抑制蛋白(Rb)，而磷酸化的Rb从其所结合的E2F转录因子上解离，从而推动细胞周期由G1期进入到S期。p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等生物学功能有关。Cyclin D1、p53是参与调节G1/S期、G2/M期最主要的蛋白，Cyclin D1、p53表达失调与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Valenti等[20]研究证实，肝癌组织Cyclin D1、p53蛋白表达显著高于癌旁正常组织，随着治疗的好转，肝癌组织Cyclin D1、p53蛋白表达量逐渐降低。本研究结果显示，突变组p53 mRNA及蛋白表达量均高于野生组和对照组，提示PNPLA3基因多态性可能通过影响肝癌细胞p53表达，达到调节细胞周期的作用。本研究还发现，突变组G1期细胞所占比例低于野生组和对照组，S、G2/M期细胞所占比例高于野生组和对照组，提示I148M多态性可能与细胞周期紊乱有关。Sookoian等[21]研究证实，肝细胞周期加速后会导致细胞内能量代谢异常，并促进肝癌细胞的生长，且细胞周期的加速与肝癌细胞的恶性程度密切相关。本研究发现，突变组p53 mRNA蛋白相对表达量高于野生组和对照组，而三组细胞Cyclin D1蛋白和mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义，提示PNPLA3基因I148M多态性可能通过上调p53表达而导致细胞周期紊乱，并促使其向肝癌发展。

综上所述，PNPLA3基因I148M多态性能够诱导p53过表达，导致肝细胞周期紊乱，最终发展为肝癌细胞。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.019

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