利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠IR及SOCS-3表达的影响

侯洪涛，裘艳梅，张建，胡义亭，王玉珍

(1 河北省人民医院，石家庄050051；2 河北医科大学第二医院)



利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠IR及SOCS-3表达的影响

侯洪涛1，裘艳梅2，张建1，胡义亭1，王玉珍1

(1 河北省人民医院，石家庄050051；2 河北医科大学第二医院)

目的 探讨利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝(NAFLD)的治疗作用及其机制。方法 制备NAFLD大鼠模型20只，随机分为高脂组、利拉鲁肽组各10只，另取10只正常大鼠作为对照组。高脂组、利拉鲁肽组高脂饲料饲养16周，对照组普通饲料饲养16周。利拉鲁肽组饲养12周末腹腔注射利拉鲁肽 600 μg/(kg·d)4周；饲养第16周末，三组均心脏取血，检测血清ALT、AST、TG、TC和空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。处死大鼠，称量体质量及肝质量，计算肝指数；取部分肝脏，HE染色，光镜下观察肝组织病理变化；另取部分肝组织，RT-PCR法检测细胞因子信号转导抑制物3(SOCS-3)mRNA表达，分析SOCS-3 mRNA表达与HOMA-IR的关系。结果 与对照组比较，高脂组肝脂数、ALT、AST、TG、TC、FPG、FINS及HOMA-IR均明显升高(P均<0.05)；与高脂组比较，利拉鲁肽组上述指标均明显降低(P均<0.05)。对照组肝组织无异常病理改变；高脂组肝细胞排列紊乱，细胞内有较多脂滴，部分肝细胞变性，有炎性细胞浸润；利拉鲁肽组肝细胞脂肪变明显轻于高脂组。高脂组肝组织SOCS-3 mRNA相对表达量明显高于对照组、利拉鲁肽组(P均<0.05)，对照组、利拉鲁肽组比较差异无统计学意义(P>0.05)。直线相关分析显示，肝组织SOCS-3 mRNA表达与HOMA-IR呈正相关(r=0.445，P<0.05)。结论 利拉鲁肽治疗NAFLD有一定效果，其作用机制可能与减轻胰岛素抵抗及抑制SOCS-3 mRNA表达有关。

非酒精性脂肪肝；胰岛素抵抗；胰高血糖素样肽1；细胞因子信号转导抑制物3

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是与代谢性疾病相关的肝脏疾病，与胰岛素抵抗(IR)、糖尿病、肥胖、高脂血症等因素密切相关，被认为是代谢综合征的肝脏表现。近年来我国NAFLD发病率显著升高，并呈年轻化趋势。NAFLD的发病机制尚未完全阐明，二次打击学说是NAFLD发病机制的经典学说[1]。IR被认为是导致肝脏脂质过度沉积的原发病因，在NAFLD的发生、发展过程中具有重要作用[2]。近年研究发现，细胞因子信号转导抑制物3(SOCS-3)可影响胰岛素信号转导，导致脂肪酸代谢紊乱，并参与IR及NAFLD的发病过程[3]。胰高血糖素样肽1(GLP-1)能改善IR及肝脏脂质沉积，已被临床用于NAFLD的治疗[4]。利拉鲁肽是GLP-1类似物，是一种治疗糖尿病的新型药物，其能否用于治疗NAFLD尚不十分清楚。2015年7～11月，本研究探讨了利拉鲁肽对NAFLD的治疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠32只，6周龄，体质量140～150 g，购自河北医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。饲养环境：温度22～24 ℃，湿度50%左右，12 h昼夜交替，分笼饲养。普通饲料及猪油，由河北医科大学实验动物中心提供；胆固醇，购自河北医科大学海森医药有限公司；利拉鲁肽，购自丹麦诺和诺德公司；胰岛素酶联免疫试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂盒、逆转录体系、扩增体系及引物，购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.2 模型制备及干预 所有大鼠适应性饲养1周，随机取22只给予高脂饲料(普通饲料88%、猪油10%、胆固醇2%)饲养制备NAFLD模型，饲养12周随机处死2只，取肝组织制作切片，行HE染色，观察到肝细胞出现明显脂肪变性，证实NAFLD模型制备成功。将20只成模大鼠随机分为高脂组、利拉鲁肽组，每组10只；两组继续高脂饲料饲养，利拉鲁肽组腹腔注射利拉鲁肽600 μg/(kg·d)，高脂组腹腔注射等体积生理盐水，连续4周。剩余10只大鼠作为对照组，予普通饲料饲养。三组均饲养至第16周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 血生化学指标 饲养至第16周末，腹腔注射麻醉，迅速心脏取血，静置2 h，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清，-70 ℃冰箱冻存备用。采用全自动生化分析仪检测血清TG、TC、ALT、AST，快速血糖仪测定空腹血糖(FPG)；酶联免疫法测定空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.3.2 肝组织病理检查 饲养至第16周末，处死大鼠，迅速取出肝脏，观察肝脏大体情况，并称质量，计算肝指数(肝指数=肝脏湿质量/体质量×100%)。每只大鼠取相同部位肝组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理变化。

1.3.3 肝组织SOCS-3 mRNA表达 取冻存肝组织100 mg，置于玻璃匀浆器中，加入TRIzol 1 mL冰上研磨，彻底匀浆。按照TRIzol试剂盒说明书提取肝组织总RNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA，以cDNA为模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。扩增产物150 bp。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，循环40次，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct值，采用2-ΔΔCt法计算SOCS-3 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组一般状态、体质量及肝指数比较 三组均全部存活；对照组皮毛光泽，灵活好动；高脂组不喜活动，皮毛光泽度差；利拉鲁肽组对外界反应灵敏，皮毛光泽度明显好于高脂组。各组体质量、肝质量及肝指数比较见表1。

2.2 各组血生化指标比较 见表2。

2.3 各组肝组织病理观察 光镜下对照组肝小叶结构清晰，肝细胞索呈放射状排列， 胞质均匀，无脂滴浸润，汇管区及小叶内无炎性细胞浸润；高脂组肝细胞排列紊乱，细胞内有较多脂滴，部分肝细胞变性，有炎性细胞浸润；利拉鲁肽组肝细胞脂肪变性明显改善，肝细胞内有少量脂肪滴，炎性细胞浸润改善。

表1 各组体质量、肝质量及肝指数比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与高脂组比较，#P<0.05。

表2 各组血生化指标比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与高脂组比较，#P<0.05。

2.4 各组肝组织SOCS-3 mRNA表达比较 对照组肝组织SOCS-3 mRNA相对表达量为1.30±0.44，高脂组为3.06±1.62，利拉鲁肽组为2.00±0.75。高脂组肝组织SOCS-3 mRNA相对表达量明显高于对照组、利拉鲁肽组(P均<0.05)，而对照组、利拉鲁肽组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 肝组织SOCS-3 mRNA表达与HOMA-IR的关系 直线相关分析显示，各组肝组织SOCS-3 mRNA表达与HOMA-IR呈正相关(r=0.45，P<0.05)。

3 讨论

NAFLD是与代谢性疾病相关的肝脏疾病，其发生、发展受代谢、遗传、环境、肠道微生物和生活方式等多种因素调节，与IR、肥胖、高脂血症等密切相关。NAFLD的发病机制目前尚未完全清楚，其理论研究还停留在假说阶段，“二次打击学说”是目前最为人们接受和认可的观点。第一次打击是以IR为中心环节导致的肝细胞脂肪变性、肝脏脂质沉积；在此基础上发生的，以线粒体反应氧体系为核心的氧化应激和脂质过氧化对肝脏的损伤是NAFLD发病中的第二次打击。

IR是NAFLD发病的中心环节，贯穿于NAFLD的全过程，不仅参与首次打击，也参与二次打击。IR引起NAFLD的可能机制：IR可减弱胰岛素对脂肪代谢的调节，使外周脂肪分解增强，血清中游离脂肪酸(FFA)浓度上升，FFA随血液循环进入肝脏增多，导致肝内TG大量合成并堆积；肝脏增多的FFA会导致肝细胞线粒体氧化超载，从而加重肝细胞内脂肪变性[5]。此外，增多的FFA还可通过抑制胰岛素信号转导，减少胰岛素清除，而加重IR。

SOCSs是一类具有抑制Janus 激酶信号转导子与转录激活子(JAK/STAT)信号转导的蛋白质家族，目前对SOCS-1和SOCS-3的研究较多。SOCS-3在体内广泛分布于肝、肾、脑、心等组织器官[6]。SOCS-3由225个氨基酸组成，分子量约为24.75 ku。人类SOCS-3基因位于17q25.3，长度为850 bp，与大鼠、小鼠的同源性约为90%。正常组织中SOCS-3低表达，许多细胞因子，如红细胞生成素、生长激素、IL-6等可诱导SOCS-3表达。这些细胞因子诱导SOCS-3表达后，其表达产物又抑制细胞因子介导的JAK/STAT信号通路。胰岛素信号传导受阻或减弱是IR的主要原因之一，SOCS-3通过多种途径参与IR：①与STAT5b竞争性结合胰岛素受体，抑制STAT5b的磷酸化及其胰岛素受体底物的磷酸化，使下游的胰岛素信号转导受阻[7]；②通过SH2结构域与信号蛋白受体上磷酸化的酪氨酸结合，干扰胰岛素信号的转导[8]；③与信号蛋白耦联，从而被蛋白酶体降解，抑制胰岛素信号的转导[9]。SOCS-3还参与抵抗素诱导的IR，抵抗素可使SOCS-3表达升高，并促进其与胰岛素受体结合，从而抑制胰岛素信号的传导[10]。应用拮抗SOCS-3的寡核苷酸对db/db小鼠进行干预，肝组织SOCS-3表达下降，脂肪肝程度明显减轻[11]。本研究结果显示，对照组肝组织SOCS-3 mRNA低表达，高脂组SOCS-3 mRNA表达显著高于对照组，说明SOCS-3参与了NAFLD的发病过程。

GLP-1是由肠道L细胞分泌的肠道激素，具有促进胰岛素释放、延缓胃排空、抑制胰高血糖素的释放等作用。GLP-1的生物学作用是靠GLP-1和细胞上的GLP-1受体结合来实现，GLP-1受体在人体内主要分布于胰岛α、β细胞，胃、小肠、肺、心脏、肾脏、垂体及下丘脑等组织。研究表明，人肝细胞亦有GLP-1受体表达[12]。利拉鲁肽和艾塞那肽均为GLP-1类似物，均通过增加胰岛素分泌、改善胰岛细胞功能、减少食物摄入量等多种机制发挥降糖作用，已广泛应用于2型糖尿病的治疗[13]。近年研究发现，GLP-1类似物对代谢综合征有治疗作用，NAFLD是代谢综合征在肝脏的表现。有研究发现，应用艾塞那肽干预ob/ob小鼠，可使小鼠体质量减轻，改善胰岛素敏感性，减轻肝内脂质沉积[14～18]。本研究结果显示，与对照组比较，高脂组体质量、肝指数明显升高，肝脏脂肪变性及炎症程度明显增加，其血清ALT、AST、FPG、FINS及HOMA-IR明显升高，表明IR在NAFLD的发生、进展过程中具有重要作用。而利拉鲁肽组上述指标及肝组织SOCS-3 mRNA表达均明显低于高脂组，说明利拉鲁肽能够改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变性。

综上所述，利拉鲁肽对NAFLD有治疗作用，其作用机制可能与减轻IR及抑制SOCS-3 mRNA表达有关。

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Effects of liraglutide on insulin resistance and SOCS-3 expression in rats with nonalcoholic fatty liver disease

HOUHongtao1,QIUYanmei,ZHANGJian,HUYiting,WANGYuzhen

(1People′sHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050051,China)

Objective To investigate the effects of liraglutide (Lira) on insulin resistance and expression of SOCS-3 in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLA). Methods Twenty NAFLD rat models were prepared and then randomly divided into high fat group (HF) and HF+Lira group. Meanwhile, another 10 normal rats were selected as the normal control (NC) group. HF group, HF+Lira group were given high fat diet for 16 weeks. After 12 weeks of high fat feeding in HF+Lira group, 600 μg/(kg·d) Lira was administered by intraperitoneal injection for 4 weeks. At the end of the 16 weeks, the rats were killed. The changes of liver pathology were observed by optical microscope. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total triglyceride (TG), cholesterol (TC) and fasting blood glucose (FPG) were detected by automatic biochemical analyzer. The fasting insulin (FINS) was determined by radioimmunoassay, and insulin resistance index (HOMA-IR) was assessed by homeostasis mode assessment. The liver expression of SOCS-3 mRNA was detected by RT-PCR. The relationship between SOCS-3 mRNA and HOMA-IR was analyzed. Results Compared with NC group, liver index, HOMA-IR, and the levels of ALT, AST, TG, TC, FPG and FINS were significantly increased in HF group (allP<0.05); compared with HF group, the above indexes of the HF+Lira group were all decreased, and the difference was statistically significant (allP<0.05). No abnormal pathological changes in the liver tissues of the NC group. In the HF group, the liver cells were arranged in disorder, there were more lipid droplets in the cells, and some hepatocytes degenerated and had inflammatory cells infiltration. The hepatic steatosis in the HF+Lira group was lighter than that in the HF group. The expression level of SOCS-3 mRNA in HF group was significantly higher than that in NC group and the HF+Lira group (allP<0.05); and no significant difference was found between the NC group and the HF+Lira group (P>0.05). HOMA-IR was positively correlated with of the expression of SOCS-3 mRNA (r=0.445,P<0.05). Conclusion Lira has certain effect in treatment of NAFLD, whose mechanism may be related to the decrease of IR and inhibition of SOCS-3 mRNA expression.

nonalcoholic fatty liver; insulin resistance; glucagon-like peptide 1; suppressor of cytokine signaling 3

河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20150117)。

侯洪涛(1980-)，男，硕士，主治医师，研究方向为消化系统疾病诊治。E-mail: llvzi@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.005

R575.5

A

1002-266X(2016)40-0017-04

2016-01-18)