黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的网络药理学研究Δ

魏士长，吴明权，王 欢，黄银秋，周厚琴，张 璐，赵艳玲#

(1.解放军第302医院药学部，北京 100039； 2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137)



黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的网络药理学研究Δ

魏士长1*，吴明权1，2，王 欢1，黄银秋1，2，周厚琴1，2，张 璐1，2，赵艳玲1#

(1.解放军第302医院药学部，北京 100039； 2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137)

目的：通过网络药理学方法，探讨黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的作用机制。方法：结合TDT数据库和PharmMapper Server数据库，筛选出黄连解毒汤的作用靶点；利用OMIM数据库，分别筛选出肝炎和肝纤维化的疾病作用靶点；将以上数据导入PPI数据库进行综合分析，进一步得出黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的“化学成分-靶点-疾病”交互网络，再将该交互网络Xgmml文件导入Cytoscapy 3.0软件进行网络可视化和各节点的拓扑参数分析，得出黄连解毒汤抗肝炎和肝纤维化相应的作用机制。结果：黄连解毒汤对肝炎的治疗作用可能是通过干预机体半乳糖凝集素3、表皮生长因子受体、磷脂酰肌醇3-激酶p85α亚基相关信号通路来实现的；而其治疗肝纤维化的作用可能是通过干预半乳糖凝集素3相关信号通路来实现的。结论：黄连解毒汤可以通过干预机体半乳糖凝集素3相关通路达到治疗肝炎的目的，并阻止肝炎向肝纤维化发展。网络药理学方法可作为药物治疗特定疾病的生物机制的计算机预测方法，对药物的发现和研究具有很好的辅助作用。

黄连解毒汤； 肝炎； 肝纤维化； 网络药理学

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏和栀子4味药组成，具有清热、泻火、解毒等功效，主治实热火毒、三焦热盛之证，为清热解毒的代表方剂。现代药理学研究结果表明，黄连解毒汤也具有较好的抗菌、抗内毒素、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用。但目前为止，对黄连解毒汤治疗急、慢性肝病的研究相对较少，而网络药理学作为新兴的技术方法可以对中药作用于机体后的多成分、多途径和多靶点进行较为全面地揭示。故本研究拟应用网络药理学分析方法，分析、预测黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据的构建、药物和疾病靶点的筛选

通过中草药综合数据库TD@T(http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/review-result.php?herbid=3496)，查找黄连解毒汤中4味药物的化学成分，并下载相应的MOL2分子结构，再登录PharmMapper数据库(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)，上传黄连解毒汤中4味药物中相应的化合物分子MOL2结构，采用“反向药效团匹配方法”筛选人类相关药物靶点。通过人类孟德尔遗传数据库OMIM(http://www.omim.org/)搜集肝炎和肝纤维化相关的疾病靶点。其他的人类交互蛋白靶点由交互蛋白数据库DIP(http://dip.doe-mbi.ucla.edu)获得。

1.2 “化合物-靶点-疾病”交互网络的构建和分析

将搜集到的黄连解毒汤中4味药中的化合物成分、药物作用靶点、疾病作用靶点通过“蛋白-蛋白”交互信息数据库PPI进行分析，将分析出来的结果导入Cytoscape 3.0软件中进行可视化并进行各靶点的相关参数分析。有效作用靶点用点度中心性、中介中心性和接近中心性3个拓扑参数进行筛选，同时将点度中心性≥2倍中位数、中介中心性和接近中心性≥1倍中位数的靶点作为本研究得到的重要靶点。

2 结果

2.1 黄连解毒汤、肝炎和肝纤维化的靶点筛选

本研究共筛选出黄柏中20个成分、721个靶点，黄连中35个、995个靶点，黄芩中20个、450个靶点，栀子中35个、1 109个靶点，以上获得的药物靶点被用来进一步构建“成分-靶点-疾病”网络。肝炎和肝纤维化对应的疾病靶点分别为203和26个。

2.2 网络构建和通路分析

网络药理学作为新兴的系统生物学分析方法，可以通过计算机方法从蛋白、分子、基因层面分析整合出药物作用于机体后的分子生物学信息，较为全面地客观揭示药物作用的方式和途径。本方法通过建立可视化的“成分-靶点-疾病”交互网络(见图1—2)，使黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的复杂的网络呈现出来，并进一步分析。图1—2中三角形代表黄连解毒汤中可能的有效活性成分，正五边形代表药物的间接作用靶点，圆点代表肝炎相关的疾病靶点，正方形代表药物和疾病都直接作用的靶点，斜正方形代表药物和疾病靶点连接的交互蛋白。

图1 黄连解毒汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis

图2 黄连解毒汤治疗肝炎的直接作用靶点一级“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 2 Direct targets of first class interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis

黄连解毒汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点的拓扑参数分析结果见表1。从表1可见，黄连解毒汤治疗肝炎的直接作用靶点共14个，分别为葡萄糖-6-磷酸异构酶、周期蛋白A2、雄激素受体、5色氨酸羟化酶1、乙型肝炎病毒激活蛋白、肝细胞生长因子受体、半乳糖凝集素3、生长因子受体结合蛋白2、CYP2C9、表皮生长因子受体、信号转导及转录激活因子1-α/β、肝配蛋白A受体2、磷脂酰肌醇3-激酶α亚基和葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶。同时，本研究对黄连解毒汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中所有的蛋白靶点都进行了拓扑参数(点度中心性、中介中心性和接近中心性)分析，3个拓扑参数的中位数值分别为1、0和0.254 028。最后，本研究选择各靶点中点度中心性≥2、中介中心性≥0、接近中心性≥0.254 028的直接作用靶点作为黄连解毒汤治疗肝炎的较为重要的靶点，即葡萄糖-6-磷酸异构酶、周期蛋白A2、雄激素受体、乙型肝炎病毒激活蛋白、肝细胞生长因子受体、半乳糖凝集素3、生长因子受体结合蛋白2、CYP2C9、表皮生长因子受体、信号转导及转录激活因子1-α/β、肝配蛋白A受体2和磷脂酰肌醇3-激酶α亚基。基于以上计算机分析结果的不确定性，本研究继续通过查阅文献进一步确认以上靶点是否都是有效靶点。结果显示，在肝脏受损时肝细胞生长因子的合成与分泌增强，血清肝细胞生长因子含量检测可能对急、慢性肝炎的鉴别具有重要意义，对不同因素导致的大鼠肝损伤具有保护作用[1-2]。因此，肝细胞生长因子受体对肝脏的保护也起着重要作用。半乳糖凝集素3蛋白对急性肝损伤具有一定的保护作用，其可能的保护机制为上调Mic和Mt中的葡萄糖调节蛋白78表达[3]。磷脂酰肌醇3-激酶p85α亚基是IA型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylcholine 3-kinase，PI3K)调节亚基的1种，是IA型PI3K中含量最丰富的亚基，能够通过调节PI3K的活性，影响IA型PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路的信号传导，而PI3K/Akt信号通路是调节血小板衍生因子促肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖与分泌胶原的重要通道，抑制该信号通路可以抑制HSC增殖和肝内细胞外基质的表达，具有抗肝纤维化的作用。阻断黏着斑激酶或PI3K可以抑制HSC的黏附和迁移，PI3K的活化对HSC I型胶原mRNA和蛋白的表达非常重要[4]。

表1 黄连解毒汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点的拓扑参数分析

由黄连解毒汤治疗肝纤维化的网络中各靶点的拓扑参数(点度中心性、中介中心性和接近中心性)分析可知，3个拓扑参数的中位数值分别为1、0和0.276 383 22。本研究选择各靶点中≥2倍中位数值的直接作用靶点作为黄连解毒汤治疗肝炎的较为重要的靶点，而该网络中的唯一的直接作用靶点符合拓扑参数筛选要求，见图3—4、表2。

图3 黄连解毒汤治疗肝纤维化的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 3 Interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of liver fibrosis

图4 黄连解毒汤治疗肝纤维化直接作用靶点的一级“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 4 Direct targets of first class interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of liver fibrosis

序号UniProt数据库识别码靶点蛋白接近中心性点度中心性中介中心性1P17931半乳糖凝集素30290932537000596164

3 讨论

黄连解毒汤作为清热解毒的代表名方，除了具有抗炎作用之外，还具有保护心血管系统、脑神经、肝脏和抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂、降血压和抗肿瘤等药理活性。随着现代药理学研究相关技术的发展，人们对黄连解毒汤的研究越来越深入。

网络药理学方法通过图形理论、数据挖掘以及信息可视化等方法，可以全面揭示药物作用于疾病的相互作用机制。同时随着医学的发展，越来越多的疾病被证明为复杂性疾病，如冠心病、糖尿病等，但针对复杂疾病仅选用单一成分、单一靶点的西药进行治疗，往往达不到理想的治疗效果。故多成分、多靶点、多层次治疗疾病的药物的发现和研究日趋重要。中药复方制剂作为传统治疗药物，能够满足人们对复杂疾病的治疗需求。网络药理学可以从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，通过网络分析药物、靶点与疾病间的相互关系，反应和揭示中药的多成分-多靶点作用关系[5]。

本研究通过网络药理学方法分析黄连解毒汤治疗肝炎和肝纤维化的分子生物学机制，发现黄连解毒汤可以通过调节肝细胞生长因子受体、半乳糖凝集素3和磷脂酰肌醇3-激酶p85α亚基相关信号通路治疗肝炎，通过干预半乳糖凝集素3信号治疗肝纤维化。由此可见，黄连解毒汤可以通过干预半乳糖凝集素3相关信号通路达到治疗肝炎和肝纤维化的效果，提示半乳糖凝集素3信号通路可能是黄连解毒汤治疗肝炎并阻止肝炎向肝纤维化发展的关键信号通路。

网路药理学方法作为中药复方制剂研发的新策略、新思路，对中医药理论的科学性以及对中药新适应证的挖掘都具有很重要的作用。但该方法仍处于发展阶段，还存在许多技术难点和不足，不过，随着网络药理学方法的完善和发展，定会为中医药的现代化发展做出很大贡献。

[1]贾俊清.肝细胞生长因子对小鼠急性肝损伤的预防和治疗作用[J].齐齐哈尔医学院学报，2005，26(9)：996-997.

[2]刘怡晟.肝细胞生长因子对大鼠急性肝损伤保护作用的实验研究[J].南京铁道医学院学报，1997，16(4)：236-239.

[3]张鸿，具英花，刘晓湘，等.Galectin-3在CCL4致肝损伤及对GRP78调控的作用[J].世界华人消化杂志，2007，15(33)：3468-3473.

[4]朱颖军，薛凤霞，高企贤.卵巢癌组织芯片中PI3Kp85α，AKT1及Ki-67表达的研究[J].天津医药，2008，36(8)：578-560.

[5]杨凯伦，王莹，艾乐.基于网络药理学方法探讨通脉养心方辨治冠心病的研究思路[J].中草药，46(20)：2979-2984.

Network Pharmacology Study on Huanglianjiedu Decoction in Treatment of Hepatitis and Liver FibrosisΔ

WEI Shizhang1，2, WU Mingquan1，2, WANG Huan1， HUANG Yinqiu1，2, ZHOU Houqin1, ZHANG Lu1，2, ZHAO Yanling1

(1.Dept.of Pharmacy, 302 Military Hospital of PLA, Beijing 100039, China; 2.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China)

OBJECTIVE：To probe into the mechanism of therapeutic action of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis and liver fibrosis through network pharmacology. METHODS: To select the targets of Huanglianjiedu decoction through TDT database and PharmMapper Server data base; and to select the targets of hepatitis and liver fibrosis through OMIM database. The targets of the data were analyzed with PPI database, and then the interactive network of “compound-target-disease” could be obtained; in addition, and the interactive network Xgmml was analyzed with Cytoscapy 3.0 software for network visualization and the topology parameter value of the dots, and the mechanism of therapeutic action of Huanglianjiedu decoction was obtained. RESULTS: The therapeutic effects of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis might concentrate on intervening the related signaling pathways of the Galectin-3, epidermal growth factor receptor, PI3-kinase subunit p85-alpha; while the liver fibrosis might concentrate on intervening the related signaling pathways of the Galectin-3. CONCLUSIONS: Huanglianjiedu decoction can in treatment of hepatitis through intervening the related signaling pathways of the Galectin-3, and prevent the development of hepatitis to liver fibrosis. Meanwhile, network pharmacology method can be regarded as the prediction method of computer in biological mechanism of medication treatment for the specific diseases, which can be regarded as a good method for the discovery and research of medicine.

Huanglianjiedu decoction; Hepatitis; Liver fibrosis; Network pharmacology

国家自然科学基金资助项目(No.81330090、No.81173571)

R96

A

1672-2124(2016)10-1308-03

2016-08-29)

*硕士研究生。研究方向：中药理论与应用。E-mail：shizhangw88@163.com

#通信作者：主任药师，博士，研究员。研究方向：中药药理学。E-mail：zhaoyl2855@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.004