黄敏欣,洪泽淳,赵文红*,朱豪,王辉,白卫东
(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225;2.广东省食品检验所,广东广州510000)
红曲对广东客家黄酒发酵及产γ-氨基丁酸的影响
黄敏欣1,洪泽淳2,赵文红1*,朱豪1,王辉1,白卫东1
(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225;2.广东省食品检验所,广东广州510000)
该该文研究了红曲对广东客家黄酒发酵及产γ-氨基丁酸(GABA)的影响。研究结果表明,红曲糖化力和液化力最高,酯化力较低;酒药的糖化力和液化力最低;麦曲酯化力高。红曲对客家黄酒发酵过程中总糖、总酸、pH、氨基酸态氮、酒精度、GABA含量影响较大,添加红曲与麦曲、酒药共酵的客家黄酒在发酵过程中微生物的代谢活动旺盛,pH、酒精度较低,总糖、总酸、氨基酸态氮含量较高,GABA含量达到最高为257.4 mg/L,是未添加红曲的黄酒2.16倍。采用红曲与麦曲、酒药共酵可提高客家黄酒的营养价值。
红曲;广东客家黄酒;发酵;γ-氨基丁酸
广东客家黄酒是客家人独有的民间传统发酵型米酒,主要分布在广东河源、梅州一带[1]。当地妇女们在坐月子期间会用客家黄酒熬姜丝和鸡肉,普通大众会将其与桂圆、红枣和人参同煮,起到调味以及滋补身体的作用。客家黄酒酿造用的酒曲含有多种微生物,这些微生物对发酵起到十分重要的作用[2]。客家黄酒主要特点是以红曲为主要酒曲,辅以麦曲和酒药的多菌种混合发酵[3],而绍兴黄酒使用麦曲酿造,这也是客家黄酒与绍兴黄酒的区别之处。
红曲是广东客家黄酒生产的糖化发酵剂之一[4],其除了能产生大量天然红曲色素以外,酶系十分丰富,产生的糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等起到糖化和酒化作用[5],并对酒的口感、风味和营养物质产生一定影响。同时,红曲一直被认为是具有药用和食用双重功效的产品,可以产生γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等次级代谢产物[6]。GABA具有提高记忆力、降血压、活化肝肾及防止动脉硬化等功能[7]。红曲对客家黄酒发酵产生的影响需深入研究,经红曲酿制的客家黄酒中GABA具体含量以及利用红曲进行发酵时GABA受到哪些影响尚不明确。因此,本研究添加不同的酒曲酿造客家黄酒,检测黄酒中发酵过程中相关物质含量的动态变化,探究红曲对客家黄酒发酵和GABA的影响,这对研究酒曲对客家黄酒发酵的作用具有十分重要的意义。
1.1材料与试剂
红曲、麦曲、酒药:广东省紫金县某酒厂提供;糯米:山西丰园食品有限公司;米酒(29度):广东石湾酒厂有限公司;GABA标准品、氨基酸混标、邻苯二甲醛(o-phthalalde-hyde,OPA)衍生剂、磷酸盐缓冲液:美国Agilent科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯):广州自力色谱科仪有限公司;无水葡萄糖、氢氧化钠、硫酸铜、冰乙酸、无水碳酸钠、无水乙酸钠(分析纯):天津富宇精细化工有限公司;磷酸二氢钠、酒石酸钾钠(分析纯):广州化学试剂厂。
1.2仪器与设备
1100系列高效液相色谱仪:美国Agilent科技有限公司;LRH-250A生化培养箱:广东省医疗器械厂;LX-C35L自动电热压力蒸汽灭菌器:合肥华泰医疗设备有限公司;BS223S电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;DHS-3C精密pH计:上海雷磁仪器厂;TG16-W高速离心机:湖南湘立科学仪器有限公司;MJ-176NR多功能粉碎机;日本松下电器产业株式会社;VAL1酒精计:上海一恒科技有限公司。
1.3实验方法
1.3.1红曲对客家黄酒发酵的影响
(1)不同酒曲配方酿造客家黄酒
采用表1的3种酒曲配方,按照客家黄酒生产工艺来酿造黄酒。客家黄酒生产工艺流程为:
原料→浸米→蒸饭→摊凉→拌曲→前发酵(7 d,32℃)→加米酒进行后发酵(23 d,20℃)→压榨→澄清→煎酒(80℃)→过滤→装坛→陈酿
表1 客家黄酒的不同酒曲配方Table 1 Different koji formula of Hakka rice wine
(2)客家黄酒发酵过程中各项指标的测定
客家黄酒中总糖、总酸、pH、氨基酸态氮、酒精度的测定:按GB/T 13662—2008《黄酒》[9]中的方法进行。
(3)酒曲发酵性能的测定
试样在规定条件下,糖化力以费林法测定所生成的葡萄糖量表示。l g绝干曲在该条件下l h能液化淀粉的克数,表示液化力的大小,以U表示。在规定的试验条件下,大曲中酯化酶催化游离有机酸与乙醇合成酯,再用皂化法测定所生成的总酯(以己酸乙酯计),表示其酯化力。酒曲糖化力、液化力、酯化力测定:按QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[8]进行。
1.3.2红曲对客家黄酒产γ-氨基丁酸的影响
高效液相色谱检测GABA条件:采用紫外检测检测器,其检测波长为340 nm;色谱柱为Agilent氨基酸柱(4.6 mm× 150 mm,3.5 μm),柱温为40℃;流动相A(NaH2PO4)= 0.02 mol/L(pH值为7.8);流动相B[甲醇(MeOH)∶乙腈(CH3CN)∶水(H2O)]=45∶45∶10(V/V)梯度洗脱程序见表2。
表2 高效液相色谱梯度洗脱的程序Table 2 Gradient elution program of high performance liquid chromatography
依次吸取0 H2O→5 μL缓冲液→1 μL OPA衍生剂→0 H2O→10 μL酒样→0 H2O→进样。
1.3.3数据分析与处理
采用SigmaPlot 11.0软件对试验结果进行统计分析,各组实验数据用X±S(平均数±标准偏差)表示。
2.1酒曲发酵性能的分析
表3 不同酒曲的发酵性能Table 3 Fermentation performance of different koji
不同酒曲的发酵性能指标见表3。由表3可知,红曲糖化力和液化力最高,分别达到(746±5.23)U和(0.671±0.003)U,酯化力较低为(8.8±0.009)g/L;酒药的糖化力和液化力最低,分别为(353±4.15)U和(0.026±0.002)U;麦曲酯化力最高,为(14.3±0.011)g/L。红曲糖化力和液化力高,微生物分解淀粉为糖的能力强,可提高黄酒总糖含量。麦曲酯化力高,可使产生较多酯类物质,香味较浓厚。酒曲复配优势互补和取长补短,利于曲霉、酵母、细菌等生长繁殖,弥补酶系不足和协调糖化发酵,改善黄酒出酒率和风味。
2.2红曲对客家黄酒发酵过程中各项指标的影响
广东客家黄酒发酵过程中总糖含量、总酸含量、pH和氨基酸态氮含量以及酒精度是微生物生长代谢和发酵的重要体现,而酒醪中GABA主要来源于微生物的生长代谢,因此,这些指标可间接说明红曲微生物的生长代谢情况,从而更好地说明红曲对客家黄酒产GABA的影响。
2.2.1红曲对发酵过程中总糖含量的变化
糖类物质能赋予客家黄酒甜味、营养及黏稠感[11],影响客家黄酒的风味,推迟苦味和涩味出现。客家黄酒中的糖类物质经淀粉类物质水解产生,形成的糖一部分以残糖形式存在于酒液中,以葡萄糖为主,其次是麦芽糖和低聚糖等,另一部分则作为营养物被微生物利用,酵母也把糖类物质当成营养物来生成酒精。
图1 红曲对客家黄酒发酵过程中总糖含量的影响Fig.1 Effect of red koji on total sugar content in fermentation process of Hakka rice wine
由图1可知,发酵初期,酒曲中霉菌等微生物生长和繁殖,可迅速地将原料淀粉进行水解,产生糖类物质,因此总糖含量急剧上升。第7天加入白酒后,发酵醪液被稀释,同时醪液中糖化菌受抑制,酵母菌发酵将部分糖分转化为酒精,发酵醪液总糖下降。到发酵后期,发酵醪液中的总糖逐渐趋于平衡,变化开始变小。第30天发酵结束时,3号黄酒总糖含量约293.4 g/L,1号黄酒总糖含量约279 g/L,2号黄酒总糖含量约160 g/L。
红曲的糖化力和液化力最高,微生物分解淀粉为糖的能力强,残糖含量高,因此1和3号黄酒总糖含量较高,2号黄酒较低;1号黄酒有麦曲和酒药参与发酵,麦曲酯化力高,促进酵母发酵生成的酒精,进而生成酯类物质,因此残糖不断被酵母利用,造成后发酵过程1号黄酒残糖量比3号黄酒残糖量少。这说明红曲作为糖化发酵剂用于客家黄酒的酿造,对糖化发酵起到重要的作用,能促进淀粉类物质水解为低分子的糖类物质,供微生物的生长繁殖所利用,有利于微生物代谢来产生更多的代谢产物。
2.2.2红曲对发酵过程中总酸含量和pH的变化
红曲发酵过程中总酸和pH值的变化见图2和图3。由图2、图3可知,总酸含量与pH值变化相对应,含酸量少则引起酒味淡薄,含酸量太大风味也受到影响。广东客家黄酒中的酸类物质主要来源于发酵过程中蛋白质酶分解蛋白质产生氨基酸、微生物呼吸作用产生CO2、酒曲中微生物大量繁殖产生酸类物质、酵母发酵产生乳酸、苹果酸及琥珀酸等有机酸,以及原料的带入等[12]。客家黄酒主酵阶段多种微生物参与发酵,生长旺盛,因此酸类物质不断积累,酒液pH下降。加入大量高浓度白酒后,酒液被稀释导致pH上升,之后几天由于酵母繁殖抑制杂菌的侵入和生长以及自身产酸,pH稍下降。发酵后期,营养物质耗尽,酶活性降低,总酸和pH基本平衡,发酵过程中1号黄酒总酸范围为5.4~7.0 g/L,pH值约为3.4,2号黄酒总酸范围为5.0~6.7 g/L,pH值约为4.1,3号黄酒总酸含量范围为3.7~4.3 g/L,pH值约为4.3。
图2 红曲对客家黄酒发酵过程中总酸含量的影响Fig.2 Effect of red koji on total acids content in fermentation process of Hakka rice wine
图3 红曲对客家黄酒发酵过程中pH的影响Fig.3 Effect of red koji on pH in fermentation process of Hakka rice wine
红曲中的微生物能产蛋白酶,将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸,为微生物生长提供营养物质[13]。麦曲也可为黄酒酿造提供多种蛋白酶,包括酸性蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶等。与1号黄酒相比,2号和3号黄酒总酸含量较低,pH值较高,这可能是1号黄酒同时含有红曲和麦曲,红曲和麦曲含有的大量微生物繁殖产生酸类物质,同时,微生物呼吸作用增强,它们分解蛋白质等有机物能力提高,因而产生酸类物质较多,而2号和3号黄酒发酵时微生物种类和数量少,分解蛋白质等有机物能力较弱,因此产生氨基酸、有机酸等酸类物质较少。这说明红曲是客家黄酒发酵过程中必不可少的酒曲,它与麦曲和酒药共同作用,能促进蛋白质等有机物分解产生氨基酸等酸类物质,同时加强微生物的呼吸等生命活动,在一定程度上促进微生物的生长代谢。
2.2.3红曲对发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
图4 红曲对客家黄酒发酵过程中氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of red koji on amino acid nitrogen content in fermentation process of Hakka rice wine
氨基酸态氮含量为判断发酵程度的一项指标,它是指以氨基酸形式存在的氮元素含量[14]。红曲发酵过程中氨基酸态氮含量的变化结果见图4。由图4可知,发酵初期,氨基酸态氮总量逐渐上升,这是因为在此期间原料等蛋白质发生水解生成了低分子肽和氨基酸。当发酵时间为12~18 d时,氨基酸态氮含量变化不大。因为酵母、霉菌等繁殖生长生成低分子肽和氨基酸,同时生成的一些肽和氨基酸被微生物当作营养物而损耗掉。到了发酵后期,酸度和酒精等因素使酵母菌、霉菌等微生物发生自溶,导致氨基酸态氮含量提高。
由图4可知,发酵过程中1号黄酒氨基酸态氮含量最高,3号黄酒次之,2号黄酒最低。因为1号黄酒和3号黄酒发酵过程中均有红曲参加,红曲中微生物发酵能力比较强,将原料、糖化发酵剂等配料中的蛋白质分解转化为较多的低分子肽和氨基酸,而后发酵阶段1号黄酒氨基态氮含量增加程度比3号黄酒高,可能是麦曲中含有的酸性蛋白酶分解蛋白质,从而造成发酵醪液中的氨基酸继续积累。这与图2、图3中总酸和pH的研究结论一致。说明红曲中微生物将蛋白质分解为氨基酸的能力较强,能发酵产生更多的氨基酸,这些氨基酸一部分留于酒液中,一部分作为营养物质供微生物的生长繁殖所利用,促进了微生物代谢产物的生成。
2.2.4红曲对发酵过程中酒精度的变化
红曲发酵过程中酒精度的变化结果见图5。发酵初期,酒曲中微生物大量繁殖,酒精含量增加。加白酒后,酒精度迅速增加,后续发酵时,营养物质耗尽,酶活性降低,一部分酒精与有机酸反应生成风味物质,另一部分挥发到空气中,酒精度有小幅度波动。当酒精度达一定值时,酵母菌活性受抑制,发酵趋于平衡。由图5可知,三种黄酒酒精度变化都呈先上升而后平缓趋势。发酵初始,分解淀粉得到的糖主要用于酵母自身生长繁殖,之后酵母菌数量达到稳定状态,糖分主要被酵母转化为乙醇,酒精度上升较快。发酵后期酒精度较高,酵母菌活性受抑制,酒精度趋于平稳,发酵结束时1号、2号和3号的黄酒酒精度分别为12.5%vol、13.6%vol和10.6%vol。
图5 红曲对客家黄酒发酵过程中酒精度的影响Fig.5 Effect of red koji on alcohol content in fermentation process of Hakka rice wine
红曲的糖化力和液化力最高,淀粉被分解为糖的能力较高,一部分糖被酵母作为营养物质利用,产生酒精。这与图1的结论一致,因为麦曲酯化力高,促进酵母发酵生成乙醇,进而生成酯类物质,说明残糖不断被酵母利用生成了较多的乙醇。因此,红曲促进淀粉等有机物的分解,生成了较多的糖被酵母利用,促进了酵母的代谢活动,有利于其代谢产物的生成。
2.3红曲对客家黄酒发酵过程中γ-氨基丁酸含量的影响
图6 红曲对客家黄酒发酵过程中GABA含量的影响Fig.6 Effect of red koji on GABA content in fermentation process of Hakka rice wine
红曲发酵过程中GABA的变化结果见图6。主发酵阶段,原料蛋白质、淀粉等营养物质不断被分解,微生物利用这些营养物质进行大量繁殖和代谢,产生的GABA明显增多[15]。加入白酒后,糖化菌等被抑制,且溶液被稀释,GABA含量下降。到后发酵到21 d时,氨基酸含量几乎维持在同一水平,增加不明显,这可能是在产生GABA的同时,酵母等微生物的生长利用了部分GABA作为营养物质。发酵后期,酸度和酒精度等因素使得霉菌、酵母菌等微生物发生自溶,因此GABA含量增加。
在黄酒发酵过程中,红曲可以起到糖化的作用,红曲中微生物能提供淀粉酶和蛋白酶等,分解淀粉为糖,分解蛋白质为小分子肽和氨基酸,为微生物供给碳源等营养物和能量,促进微生物的代谢活动。1号黄酒和3号黄酒产生了更多的GABA,发酵结束时1号黄酒和2号黄酒的GABA含量分别是257.4 mg/L、118.9 mg/L,1号黄酒的GABA含量是2号黄酒的2.16倍,这是因为采用红曲进行发酵,红曲中的微生物耐酸、耐高温及乙醇,发酵过程中蛋白质被分解为氨基酸等营养物质的程度较彻底,因此利用这些营养物质来进行生命活动的微生物代谢加强,产生更多的GABA。
红曲糖化力和液化力最高,酯化力较低;酒药的糖化力和液化力最低;麦曲酯化力高。在客家黄酒发酵过程中,红曲对总糖、总酸、pH、氨基酸态氮、酒精度、GABA含量的影响较大,添加红曲与麦曲、酒药共酵的客家黄酒在发酵过程中微生物的代谢活动旺盛,pH、酒精度较低,总糖、总酸、氨基酸态氮含量较高,GABA含量达到最高为257.4 mg/L,是未添加红曲的黄酒2.16倍,因此红曲有利于广东客家黄酒的发酵及γ-氨基丁酸的产生,可提高客家黄酒的营养。
广东客家黄酒发酵是以红曲为主,麦曲和酒药为辅,进行开放式的、多菌种的混合发酵。因此,除了探讨红曲中各种微生物对客家黄酒产GABA的影响外,还需研究麦曲和酒药中存在哪些微生物对GABA有影响。黄酒发酵过程中,微生物的发酵环境较复杂,存在多种微生物共同发酵,那么微生物之间是否有协同或者相互抑制作用影响了GABA生成,仍需进一步研究。
[1]陈晓芸.广东客家娘酒传统酿造工艺研究及主要酒曲微生物的分离和特性[D].南昌:南昌大学,2011.
[2]冯爱军.广东客家黄酒中风味物质研究[D].福州:福建农林大学,2011.
[3]莫依灿,钟伟俊,何湛,等.黄酒中乳酸菌的研究进展[J].中国酿造,2015,34(9):5-8.
[4]朱豪.广东客家黄酒中γ-氨基丁酸的研究[D].广州:仲恺农业工程学院,2014.
[5]赵文红,莫依灿,洪泽淳,等.红曲对广东客家黄酒抗氧化活性的影响[J].现代食品科技,2016,32(1):143-150.
[6]张庆庆,刘辉,汤斌,等.柱前衍生化毛细管电泳法测定红曲酒中γ-氨基丁酸含量[J].食品与发酵工业,2009,35(12):119-122.
[7]王辉,项丽丽,张锋华.γ-氨基丁酸(GABA)的功能性及在食品中的应用[J].食品工业,2013(6):186-189.
[8]白卫东,黄敏欣,洪泽淳,等.红曲对广东客家黄酒发酵过程中氨基酸的影响[J].食品工业,2015(12):46-49.
[9]方晓弟,白卫东,赵文红,等.响应面法优化低聚异麦芽糖客家娘酒的发酵工艺[J].中国酿造,2013,32(2):41-44.
[10]曾令琴,葛毅强,周传云,等.泰国优质甜酒曲中根霉发酵特性的研究[J].食品科技,2005,30(3):14-16.
[11]程秀秀.黄酒组成成分与原料糯米营养成分的相关性研究[D].杭州:浙江农林大学,2014.
[12]吴连军.石榴酒发酵影响因子的研究[D].泰安:山东农业大学,2007.
[13]左楠楠.红曲黄酒酿造关键技术的研究[D].金华:浙江师范大学,2013.
[14]陈郁,周小锋,于文博,等.近红外光谱法测定黄酒中氨基酸态氮和酒精度的研究[J].计算机与应用化学,2008,25(3):361-364.
[15]谢菲,尹京苑,高海燕,等.大豆发芽过程理化特性和γ-氨基丁酸关系的研究[J].食品科技,2013,38(4):49-53.
Effect of red koji on fermentation and γ-aminobutyric acid production of Guangdong Hakka rice wine
HUANG Minxin1,HONG Zechun2,ZHAO Wenhong1*,ZHU Hao1,WANG Hui1,BAI Weidong1
(1.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China; 2.Guangdong Provincial Institute of Food Inspection,Guangzhou 510000,China)
Effect of red koji on fermentation and γ-aminobutyric acid(GABA)production of Guangdong Hakka rice wine were studied.The results showed that saccharification and liquefying power of red koji were the highest,but esterification power was a little lower.The saccharification and liquefying power of Chinese yeast starter were the lowest,while esterification power of wheat koji was high.During fermentation process of Hakka rice wine,the red koji had great effect on total sugar,total acid,pH,amino nitrogen acid,alcohol content and GABA.The microorganisms of the Hakka rice winewiththeinoculumofredkoji,wheatkojiandChineseyeastmixturehadhighmetabolicactivity.The pH and alcohol content was low,while the total sugar,total acid,and amino nitrogen acid content was high,and GABA content reached the highest of 257.4 mg/L,which was 2.16 times of the wine without red koji.The co-fermentation of red koji,wheat koji and Chinese yeast starter could improve the nutritional value of Hakka rice wine.
red koji;Guangdong Hakka rice wine;fermentation;γ-aminobutyric acid
TS262.4
0254-5071(2016)10-0046-05
10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.011
2016-05-24
仲恺农业工程学院研究生科技创新基金资助项目(KA151495003);广东省产学研项目(2013B090600157);广东省自然科学基金项目(2014A030313592);广东省教育厅重点项目(201509010005)
黄敏欣(1990-),女,硕士研究生,研究方向为食品科学。
赵文红(1966-),女,教授,硕士,研究方向为食品生物技术。