猪细环病毒k2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

陈如敬，黄秋宇，修金生，吴学敏，严 山，车勇良，周伦江

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013；2. 福建省龙岩市农业学校，龙岩 364000；3. 福建农林大学动物科学学院，福州 350002）

·研究论文·

猪细环病毒k2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

陈如敬1，黄秋宇2，修金生3，吴学敏1，严 山1，车勇良1，周伦江1

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013；2. 福建省龙岩市农业学校，龙岩 364000；3. 福建农林大学动物科学学院，福州 350002）

为建立检测猪细环病毒k2型（Porcine Torque teno sus virus k2，PTTSuVk2）SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，本研究根据PTTSuVk2 ORF2基因序列特征设计引物，建立基于SYBR GreenⅠ检测PTTSuVk2的实时荧光定量PCR方法，该方法在PTTSuVk2 ORF2基因含量为1.92×102～ 1.92×107copies/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物溶解曲线分析仅出现单一特异峰，无引物二聚体，Tm值为（83.83±0.08）℃，对猪圆环病毒（Porcine circovirus type 1 and type 2，PCV1和PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪博卡病毒5型（Porcine bovavirus type 5，PboV5）、猪细环病毒1a型（PTTSuV 1a）和1b型（PTTSuV 1b）核酸均无阳性信号扩增，可重复性好，组内变异系数为0.39%～1.69%，组间变异系数0.69%～2.19%。本方法的建立可用于定量分析PTTSuVk2感染噬性组织器官和感染程度，为PTTSuVk2的流行病学研究及临床诊断等提供了一种可靠的方法。

猪细环病毒k2型；ORF2基因；SYBR GreenⅠ；实时荧光定量PCR方法

细环病毒科（Anelloviridae）目前有11个属（Genera）[1]。猪细环病毒k2型（Porcine torque teno sus virus k2，PTTSuVk2）属于细环病毒科、Kappa细环病毒属，该属目前只有一个代表种，为猪细环病毒2p株（GenBank登录号：AY823991）[2,3]。猪细环病毒基因组与猪细环病毒1a型（PTTSuV 1a）和1b型（PTTSuV 1b）组成类似，均为无囊膜的单股环状DNA病毒，病毒全基因组大小约2．8～3．0 kb，由5'端非翻译区（untranslated region，UTR）、3'端非翻译区（UTR）和两个主要开发阅读框（open reading frame，ORF）ORF1和ORF2组成，其ORF3由ORF2和ORF1剪切形成[4-8]。ORF2长度为68个氨基酸，推测编码的蛋白具有酪氨酸磷酸酶的特征，但具体生物学功能还未明确。本研究根据猪细环病毒k2型ORF2基因片段特征设计引物，建立检测猪细环病毒k2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。

1　材料与方法

1.1 毒株 猪圆环病毒和猪细小病毒由福建省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室（以下简称本研究室）分离鉴定保存；猪细环病毒病毒1a型和1b型、猪博卡病毒5型和猪细环病毒k2型核酸由本研究室鉴定并保存。

1.2 主要试剂 EasyPure Blood Genomic DNA Kit、TransStart Top Green qPCR SuperMix、2×TransTaq-T PCR SuperMix、Agarose、GelStain、Trans5αChemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T载体、DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；Plasmid Mini Kit I和Gel Extraction Kit购自Omega Bio-Tek公司中国总代理广州飞扬生物工程有限公司；荧光定量PCR管购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.3 猪细环病毒k2型ORF2基因的克隆

1.3.1 ORF2全长基因引物设计 根据本研究室前期分子流行病学调查结果，检测到1份猪血清DNA中有猪细环病毒k2型阳性。根据猪细环病毒k2型 ORF2全长基因特征设计特异性引物。ORF2F：5'-AGTTACTGAGAGCGGAGTCAA -3'；ORF2R：5'-AACCAGTGTCCGTAGCTCAA -3'，目的片段大小约为373 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 ORF2全长基因的克隆 以鉴定的猪细环病毒k2型DNA为模板，对猪细环病毒k2型ORF2全长基因进行PCR扩增。扩增体系（50 μL）：2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL、上下游引物（20μm/mL）各1 μL、DNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终浓度50 μL。反应条件：95℃ 预变性 5 min后进入循环，循环参数为94℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸30 s，35个循环后，72℃延伸10 min。取PCR产物5 μL，在1．0 %琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经胶回收试剂盒切胶回收后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，随机选择8个克隆用质粒提取质粒，用PCR方法鉴定重组质粒，随机选择3份阳性重组质粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。测序结果经BLAST分析表明该阳性重组质粒符合预期，即随机选择1份阳性质粒作为实时荧光定量PCR方法的阳性标准品（T-ORF2）。

1.4 猪细环病毒k2型SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR方法的建立

1.4.1 引物设计及合成 根据1．3克隆测序结果结合GenBank登录的猪细环病毒k2型ORF2全长基因特征，设计实时荧光定量PCR的特异性引物，利用BLAST进行检索，初步验证其特异性。ORF2-SYF：5'- GATTATTCTGCGGCTGTAAAG -3'；ORF2-SYR：5'- CATCTTCGTGTCGGTCTC -3'，预计扩增片段长度为93 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.2 反应条件的优化 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix推荐的20 μL反应体系，以出现最高的荧光值（△Rn）、最小的Ct值以及在溶解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度（54℃～64℃）进行优化。

1.4.3标准曲线的建立 用紫外分光光度计测定阳性标准品T-ORF2含量，利用微量核酸测定仪测定质粒浓度，计算DNA拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续10倍系列稀释（10-2～10-7），以1．4．2优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

1.4.4 特异性检测 用1．4．2优化的条件分别对猪圆环病毒（Porcine circovirus 1，PCV1）和（Porcine circovirus 2，PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪细环病毒病毒1a型（Porcine torque tenovirus 1，PTTSuV1）和1b型（Porcine torque tenovirus 2，PTTSuV2）和猪博卡病毒5型（Porcine bocavirus，PBoV5）进行检测，评价其特异性。

图1　实时荧光定量PCR扩增动力曲线Fig. 1 The dynamic curve for real time PCR

1.4.5 变异系数测定 对同一阳性标准品设3个重复管，用优化的实时荧光定量PCR条件进行对阳性标准品进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将该标准阳性样本置于-20℃冰箱保存，分别于第2周、第4周和第6周后重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。

1.5 建立的实时荧光定量PCR方法的初步应用 将建立的实时荧光定量PCR方法，对临床送检15份经临床诊断患猪断奶后多系统衰弱综合症（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）仔猪血液，利用EasyPure Blood Genomic DNA Kit提取其DNA后进行实时荧光定量检测，并和常规PCR方法进行比较。

2　结果

2.1 优化的实时荧光定量PCR条件 优化出的20 μL最佳反应体系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、上下游引物（10 μmol/mL）各0．2 μL、模板2 μL、补充灭菌去离子水至20 μL。最佳反应条件：95℃预变性2 min后进入循环，95℃变性15 s、58℃延伸10 s、72℃退火15 s，共40个循环；循环结束后，制作溶解曲线。

2.2 实时荧光定量PCR标准曲线 阳性标准品的扩增曲线（图1）和标准曲线（图2）显示，实时荧光定量PCR对猪细环病毒K2型为19．2 copies/μL反应，并且在1．92×102～1．92×107copies/μL反应范围内有很好的线性关系。所建立的标准曲线的斜率为-3．459，Y轴截距31．86。相关系数为0．999，扩增效率（R2）为99．8%。

2.3 实时荧光定量PCR溶解曲线分析 从溶解曲线分析可见，在Tm=（83．83±0．08）℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物（图3）。

2.4 实时荧光定量PCR特异性 实时荧光定量PCR对阳性标准品的扩增产物经溶解曲线分析只有1个特异性峰，而猪圆环病毒（PCV1和PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪细环病毒1a型和1b、猪博卡病毒5型（PBoV5）基因组DNA均未检测到阳性荧光信号（图4），PCR产物经常规电泳也未见条带。

图2　实时荧光定量PCR标准曲线Fig. 2 The standard curve for real time PCR

图3　实时荧光定量PCR溶解曲线的建立Fig. 3 The melting curve for real time PCR

图4　实时荧光定量PCR特异性检测结果Fig. 4 The specifi city test of real time PCR

2.5 实时荧光定量PCR重复性与再现性 实时荧光定量PCR 检测标准阳性样品的组内变异系数为0．39%～1．69%，组间变异系数0．69%～2．19%，见表1。

2.6 实时荧光定量PCR对临床样品的检测 对临床送检15份经临床诊断患猪断奶后多系统衰弱综合症（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）仔猪血液，利用EasyPure Blood Genomic DNA Kit提取其DNA后进行实时荧光定量检测，并和常规PCR方法进行比较。结果可见，有2份样品检测阳性，常规PCR方法检测也仅有2份阳性，符合率为100%。

表1　实时荧光定量PCR组内和组间统计Table 1 The intra group and inter group statistics for real time PCR

3　讨论

病毒的分离鉴定是研究新发传染疫病的重要研究手段。目前尚无猪细环病毒病毒1a型和1b型以及猪细环病毒K2型成功培养的研究报道，这极大限制了对猪细环病毒的深入研究。关于猪群细环病毒感染的研究主要集中在分子流行病学调查和基因组结构分析研究方面。猪群中的细环病毒可以经过粪—口传播、精液垂直传播、疫苗传播等[9-12]。此外，猪群细环病毒也和其他病毒混合感染[13-17]。

猪细环病毒k2型（PTTSuVk2）是ICTV根据猪群感染细环病毒的特征，并对其ORF1基因核苷酸序列进行分析后，建议设立的一个新的属：Kappa细环病毒属[18]。目前，GenBank中关于猪群感染细环病毒的序列信息还比较杂乱无章，很多学者在上传相关研究序列至GenBank时并未对猪细环病毒病毒1a型和1b型（PTTSuV1和PTTSuV2）感染还是猪细环病毒k2型（PTTSuVk2）感染加以明确，有不少上传序列并未获得完整的ORF-1序列，绘制遗传进化时可能导致错误，对该病的研究造成极大困扰。

目前，检测猪群感染细环病毒的手段较多，主要有PCR（多重PCR）、实时荧光定量PCR（SYBR GreenⅠ和TaqMan探针）、LAMP和DHPLC等[19,20]，但由于不同猪群感染细环病毒类型之间核苷酸差异较大，有部分文章发表时ICTV还未对猪群感染细环病毒类型进行正确划分，建议还是在先分型的基础上再建立相应的检测方法，以免造成检测结果的假阴性。本研究建立了针对猪细环病毒k2型ORF2基因基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR 方法，该方法线性关系好、扩增效率高；组内和组间的变异系数小（分别为0．39%～1．69%、0．69%～2．19%）；准确性高，在1．92×102～1．92×107拷贝/反应范围主要内有很好的线性关系；特异性强，对其他常见猪群DNA病毒病检测结果均为阴性，可用于猪群PTTSuVk2的流行病学监测和感染器官的定量分析，为猪细环病毒k2型的流行病学研究及临床诊断等提供了一种可靠的方法。

[1] ICTV． Virus taxonomy:2015 release[EB/OL]． http: // ictvonline．org/virusTaxonomy．asp

[2] Biagini P． Create genus Kappatorquevirus in the family Anelloviridae[J]． ICTV, 2010,005:a-dV．

[3] 王礞礞, 周艳君, 陈宗艳, 等． 我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析[J]． 中国预防兽医学报, 2009, 31(10): 751-755．

[4] 刘建波, 刘长明． 猪细环病毒流行病学调查与遗传变异研究进展[J]． 动物医学进展, 2012, 33(3): 89-93．

[5] Niel C, Diniz-Mendes L, Devalle S． Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV) complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup[J]． J Gen Virol, 2005, 86: 1343-1347．

[6] Huang Y, Ni Y, Dryman B, et al． Multiple infection of porcine Torque teno virus in a single pig and characterization of the full-length genomic sequences of four U．S． prototype PTTV strains: implication for genotyping of PTTV[J]． Virology, 2010, 396(2): 289-297．

[7] Cortey M, Macera L, Segalés J, et al． Genetic variability and phylogeny of Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) and 2 (TTSuV2) based on complete genomes[J]． Vet Microbiol, 2011, 148(2-4): 125-131．

[8] Li K, Wang L, Wu Y, et al． Molecular detection and genomic characterization of Torque teno sus virus 1 and 2 from domestic pigs in central China [J]． Virus Genes, 2013, 46(3): 479-486．

[9] 翟少伦, 龙进学, 岳城, 等． 中国部分地区猪细环病毒1型和2型的分子检测[J]． 微生物和感染, 2010, 5(2): 84-88

[10] Zhai S L, Long J X, Wei W K, et al． High prevalence of torque teno sus virus in China and genetic diversity ofthe 5' non-coding region [J]． Arch Virol, 2013, 158(7): 1567-73．

[11] Pozzuto T, Mueller B, Meehan B, et al． In utero transmission of porcine torque teno viruses[J]． Vet Microbiol, 2009, 137(3-4): 375-379．

[12] Martínez-Guinó L, Kekarainen T, Segalés J． Evidence of Torque teno virus (TTV) vertical transmission in swine [J]． Theriogenology, 2009, 71(9): 1390-1395．

[13] Aramouni M, Segalés J, Cortey M, et al． Age-related tissue distribution of swine Torque teno sus virus 1 and 2 [J]． Vet Microbiol, 2010, 146(3-4): 350-353．

[14] Nieto D, Aramouni M, Grau-Roma L, et al． Dynamics of Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) and 2 (TTSuV2) DNA loads in serum of healthy and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected pigs [J]． Vet Microbiol, 2011, 152(3-4): 284-190．

[15] 刘建波, 郭龙军, 危艳武, 等． 猪输血传播病毒（TTV）与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV异常变异分析[J]．中国预防兽医学报, 2011, 33(1): 6-10．

[16] 韦建兴, 梁兆强, 欧阳康, 等． 猪细环病毒的检测及与多种病原混合感染的调查分析[J]． 中国畜牧兽医, 2013, 40(10): 197-202．

[17] 施研进, 王礼伟, 屈勇刚, 等． 新疆北疆地区猪Torque teno 病毒的PCR检测和序列分析[J]． 中国人兽共患病学报, 2014, 30(3): 255-254．

[18] Gallei A, Pesch S, Esking W, et al． Create genus Kappatorquevirus in the family Anelloviridae Porcine Torque teno virus: determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR, detection of frequent multiple infections with genogroups 1 or 2, and establishment of viral full-length sequences[J]． Vet Microbiol, 2010, 143 (2-4): 202-212．

[19] 向海洋, 聂福平, 杨俊, 等． 猪细环病毒LAMP检测方法的建立[J]． 中国预防兽医学报, 2013, 35(9): 747-751．

[20] 杨春华, 周延, 孙思扬, 等． 猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用[J]． 中国兽医学报, 2012, 43(9): 1422-1428．

DEVELOPMENT OF A SYBR GREENⅠ QUANTITATIVE REAL-TIME PCR METHOD FOR PORCINE TORQUE TENO SUS VIRUS K2

CHEN Ru-jing1, HUANG Qiu-yu2, XIU Jin-sheng3, WU Xue-min1, YAN Shan1, CHE Yong-liang1; ZHOU Lun-jiang1
(1. Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Fujian Longyan Agricultural School, Longyan 364000, China; 3. College of Animal Sciences, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

In order to rapidly and quantitatively detect Porcine Torque teno sus virus k2 (PTTSuVk2) , a SYBR GreenⅠ-based quantitative real time PCR assay was developed using specifi cally paired primers targeting to the ORF2 gene of PTTSuVk2. The PCR assay was linear in the range of 1.92×102～1.92×107copies per microliter. A series of experiments were carried out to assess the sensitivity, specifi city and reproducibility of the method, followed by the intra-assay and inter-assay CVs for CT values obtained with the standard plasmids. The melting curve analysis using SYBR GreenⅠ dye showed one specifi c peak with a melting temperature (Tm) at (83.83±0.08) ℃ without primer-dimers peak. The intra-assay CVs were equal or less than 1.69 % and the inter-assay CVs were equal or less than 2.19 %. No cross-reaction occurred with nucleic acids extracted from Porcine circovirus (type 1 and type 2), Porcine parvovirus,Porcine bovavirus type 5 and Porcine torque teno virus 1a and 1b. The results demonstrated that the assay was specifi c and reproducible, suggesting the quantitative PCR might be used for rapid laboratory diagnosis and epidemiological investigation for PTTSuVk2.

Porcine Torque teno sus virus k2; ORF2 gene; SYBR Green I; real time PCR

S852.659.2

A

1674-6422（2016）05-0010-06

2016-01-21

福建省属公益类科研专项（2014R1023-13、2015R1023-10）

陈如敬，男，硕士，主要从事动物传染病研究

周伦江，E-mail：lunjiang@163．com