上海市犬流行性乙型脑炎血清流行病学调查与分析

钟登科，魏建超，赵秋华，张克龙，李伦峰，石 坤，顾剑新，秦爱建

（1. 上海农林职业技术学院，上海 201600；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009； 3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；4.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109）

·研究论文·

上海市犬流行性乙型脑炎血清流行病学调查与分析

钟登科1,2，魏建超3，赵秋华4，张克龙3，李伦峰3，石 坤3，顾剑新1，秦爱建2

（1. 上海农林职业技术学院，上海 201600；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009； 3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；4.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109）

为了解上海市犬流行性乙型脑炎（japanese encephalitis，JE）的感染状况及其流行特点，本研究应用血凝抑制试验对2013～2014年采自上海市的653份犬血清进行了日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）抗体检测，共检出阳性血清195份，总阳性率为29.86%，并比较分析不同季节、城市区域、生存环境、年龄和性别的犬JEV抗体阳性率的差异。结果表明，犬JEV抗体阳性率与JE流行季节有相关性，在不同城市区域和生存环境中差异有显著统计学意义（P＜0.05），而不同性别和不同年龄犬JEV抗体阳性率差异不具有统计学意义（P＞0.05）。调查结果表明上海市犬JEV感染率较高，应加强犬JEV的监测与防控。

流行性乙型脑炎；血凝抑制试验；血清学调查；犬

流行性乙型脑炎又称日本脑炎(japanese encephalitis，JE) ，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染引起的一种严重的损害中枢神经系统的人畜共患传染病[1]。该病具有明显的季节性，多发生于蚊虫孳生的夏秋季节。JEV以三带喙库蚊为主要传播媒介，可以通过叮咬将病毒传染给人和动物。现已报道自然界中有60多种动物可感染JEV，例如猪、马、牛、山羊、绵羊、猴、野禽和啮齿动物等。此外，国内外一些研究结果表明犬也能感染JEV，且抗体阳性率较高[2]。

随着我国社会经济的发展和城市化进程加快，近年来犬作为伴侣动物日益成为人们生活的一部分。上海市犬的数量逐年增大，与人类关系愈来愈密切，所以无论是从动物的健康出发还是出于对公共卫生的考虑，了解本地区犬的JEV感染情况都势在必行。因此，本研究采用血凝抑制试验对上海市犬流行性乙型脑炎病毒的感染情况进行血清学调查，旨在掌握该地区犬的流行性乙型脑炎病毒感染情况和流行规律，为流行性乙型脑炎的研究和防控提供参考依据。

1　材料与方法

1.1 犬血清样品的收集 2013～2014年分别在上海市长宁区、徐汇区、闵行区、奉贤区和松江区的犬类免疫点、宠物医院、饲养场以及流浪犬收容所随机采集犬血液样本653份，所有样本均注明来源地、采样时间、犬龄、性别及健康状况等。血样送回实验室后离心分离血清，置于－20℃保存备用。

1.2 试剂 流行性乙型脑炎病毒血凝抑制试验（hemagglutination，HI）诊断试剂，购自中国疾病预防控制中心病毒所；犬流行性乙型脑炎病毒阳性血清由本研究室前期采用107PFU的JEV（SHJEV01）人工感染比格犬制备（HI 效价为1:160），其阴性血清采自感染前比格犬血液制备（HI 结果为阴性），其他试剂均自行配制。

1.3 方法 血凝抑制试验按文献[3]的方法进行。用12．5%高岭土溶液及鹅红细胞吸附待检血清，直至完全不凝集0．5%鸽红细胞，HI试验采用4 个单位的血凝素。取清洁干燥96孔V型微量板，于1～6孔中加入pH9．0硼酸盐缓冲液，每孔25μL，再加入 1∶10血清（25 μL）于第1孔，依次倍比稀释至第6孔，第6孔弃掉25 μL，再于每孔中加入25 μL4个单位的血凝素抗原25 μL，充分混匀；第7孔加入1∶10血清（50 μL）作血清对照，第8孔加入50 μL pH 9．0硼酸盐缓冲液作细胞对照。加盖置室温1 h，最后于每孔中加入50 μL的0．5%鹅红细胞悬液，充分混匀，置室温l h后判断结果。结果判定：HI 效价大于1:20判为阳性，试验孔全部呈现+++和++++的红细胞凝集为阴性结果，以++凝集孔作为该份血清的终点抑制效价。

1.4 统计学分析 用SPSS 16．0软件对各组阳性率进行卡方检验，计算χ2值，P＜0．05和P＜0．01表示为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1 样品来源与犬JEV抗体总阳性率 共采集犬血液样本653份，其中393份采自上海市长宁区、徐汇区、闵行区、奉贤区和松江区的十余家犬类免疫点或宠物医院，另外分别有98份、162份来源于上海市某流浪犬收容所以及某饲养场。经血凝抑制试验检测，检出JEV抗体阳性样品195份，总阳性率为29．86%。

2.2 犬JEV感染率与季节的关系 6～9月是上海市蚊子孳生期，亦是JE的流行期。对每个月犬的JEV抗体阳性数进行统计分析，春季（3～5月）JEV抗体平均阳性率为17．04%，显著低于流行季节后秋、冬季的JEV抗体平均阳性率（44．60%、36．53%）（P＜0．01)（表1），说明上海市犬的JEV感染具有一定的季节性。

2.3 犬JEV感染率与城市区域的关系 对上海市中心城区（长宁区、徐汇区）、近郊（闵行区）、远郊（松江区、 奉贤区）3个不同区域犬进行分类和抗体检测，中心城区和近郊的阳性率较低，分别为17．87%和23．44%。而以远郊阳性率较高，为47．79%（表2），且与中心城区和近郊的差异具有显著统计学意义（P＜0．05）。

表1　上海市不同月份犬JEV抗体检测结果Table 1 Seroprevalence of JEV antibodies in dogs in different months in Shanghai

表2　上海市不同区域犬JEV抗体检测结果Table 2 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs from different areas in Shanghai

2. 4 犬JEV感染率与生存环境的关系 根据犬生存环境的不同，将犬分为宠物犬、养殖场犬和流浪犬三类，分别统计犬JEV抗体检测结果。结果显示，流浪犬的JEV抗体阳性率最高，为48．98%，其次是养殖场犬，宠物犬JEV抗体阳性率显著低于前两者，仅为20．10%（表3）。

2.5 犬JEV感染率与年龄的关系 按照不同年龄段（＜1岁、1～2岁、2～3岁、大于3岁和年龄不详共5组）对JEV抗体阳性率进行统计。结果显示：小于1岁的犬JEV抗体阳性率为25．33%；1～2岁龄的犬阳性率为29．59%；2～3岁龄的犬阳性率为34．23%；3岁以上的犬阳性率为36．72%。可见，JEV抗体阳性率呈现随年龄增长呈上升趋势，但不同犬龄间差异不具备显著统计学意义（P＞0．05）（表4）。

表3　上海市不同环境中犬JEV抗体检测结果Table 3 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs from different environment in Shanghai

表4　上海市不同年龄犬JEV抗体检测结果Table 4 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs of different age in Shanghai

2.6犬JEV感染率与性别的关系 对不同性别（雄或雌）犬的JEV抗体阳性数进行统计分析，雄性和雌性犬抗体阳性率分别为32．63%（109/334）、26．96%（86/319），两者无统计学差异（P＞0．05），提示不同性别的犬感染情况不存在明显的差异性。

3　讨论

犬是人类的最重要伴侣动物之一。近年来，犬的数量不断增加，与人类关系愈来愈密切。本研究应用血凝抑制试验检测了采自上海市不同区域的653份犬血清样品，检出JEV抗体阳性样品195份，总阳性率为29．86%，表明上海地区犬JEV感染率较高。犬与人生活在同一生活范围，且没有注射JEV疫苗，犬JEV抗体阳性率能反映人所处环境中蚊子携带JEV的情况。因此，犬可作为一种哨兵动物来评估人受到JEV感染的风险性。

目前检测JEV抗体的方法有很多，包括血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和ELISA等[4]。其中血凝抑制试验具有简便、快速、灵敏、准确等特点，且不需要专门的仪器，受操作人员的主观因素影响较小，更适合大量样品的犬JEV抗体检测评估。因此，本研究选定血凝抑制试验作为犬JE血清流行病学调查的检测方法。同时，本研究采用鹅红细胞泥吸附待检血清，这样既没有改变待检血清的体积，又有效地消除了血清中非特异性凝集。

上海属亚热带海洋性季风气候，6～9月温度较高（气温20℃～31℃），雨量充沛，空气湿度较大，适宜蚊虫媒介孳生，蚊媒密度高，容易传播JEV[5]。本研究发现犬抗体阳性率与JE流行季节（6～9月）相关，抗体阳性率在流行季节后有明显的升高，10月和11月抗体阳性率分别高达50．72%和46．30%，显著高于JEV流行季节前JEV抗体阳性率（P＜0．01)，上海地区犬的JEV感染具有一定的季节性。

本研究调查结果显示上海市远郊区域（松江区、奉贤区）犬JEV抗体阳性率为47．79%，显著高于中心城区和近郊（17．87%、23．44%）（P＜0．05），且流浪犬和养殖场犬的JEV抗体阳性率分别为48．98%、 41．98%，显著高于宠物犬（20．10%）（P＜0．05）。Shimoda等[6]研究结果也显示，乡村犬的JEV抗体阳性率（43%）显著高于城市犬（21%），且室外犬（38%）和室内犬（10%）的JEV中和抗体阳性率之间差异具备显著统计学意义。这可能与犬的所在生存环境因素有关，如宠物犬绝大多数饲养在室内，户外活动相对较少，减少了被蚊媒叮咬的概率，而流浪犬长期在户外逗留，流浪犬收留所和犬养殖场均在远郊区域，那里存在大量蚊媒孳生的稻田，蚊媒密度高，使得犬与蚊媒接触频率增大，增加了感染JEV的概率[7]。这可能是导致远郊区域JEV感染率和流浪犬、养殖场犬JEV抗体阳性率较高的主要原因，但也需要进一步的研究来验证。

本研究初步明确了上海市犬流行性乙型脑炎流行特征，有助于流行性乙型脑炎的科学合理的防控，并对于保障公共卫生安全有重要意义。

[1] 杜立中, 魏建超, 马志永． 流行性乙型脑炎流行病学新进展及面临的挑战[J]． 畜牧与兽医, 2014, 46(10): 116-119．

[2] Shimoda H, Inthong N, Noguchi K, et al． Development and application of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay for serological survey of Japanese encephalitis virus infection in dogs[J]． J Virol Methods, 2013, 187(1): 85-89．

[3] 宋大伟, 魏建超, 郑其升, 等． 新型SPA协同凝集试验与血凝抑制试验检测猪乙型脑炎病毒特异性抗体的比较[J]．畜牧与兽医, 2006, 38(6): 44-46．

[4] 殷震, 刘景华． 动物病毒学[M]． 2版． 北京: 科学出版社, 1997． 633-641．

[5] 李燕婷, 朱奕奕, 金必红, 等． 上海市流行性乙型脑炎流行病学分析[J]． 中国疫苗和免疫, 2009, 15(6): 507-510．

[6] Shimoda H, Ohno Y, Mochizuki M, et al． Dogs as sentinels for human infection with Japanese encephalitis virus[J]． Emerg Infect Dis, 2010, 16: 1137-1139．

[7] 邓绪芳, 史子学, 邱亚峰, 等． 流行性乙型脑炎病原生态学的研究概况[J]． 动物医学进展, 2011, 32( 2) : 111-114．

SEROLOGICAL SURVEY OF JAPANESE ENCEPHALITIS IN DOGS IN SHANGHAI

ZHONG Deng-ke1,2, WEI Jian-chao3, ZHAO Qiu-hua4, ZHANG Ke-long3, LI Lun-feng3, SHI Kun3, GU Jian-xin1, QIN Ai-jian2
(1. Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201600, China; 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 4. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai, Shanghai 201109, China)

To understand the infection status and epidemiological features of Japanese encephalitis virus(JEV) in dogs in Shanghai, 653 canine serum samples were collected from 2013 to 2014 in Shanghai for detection of anti-JEV antibodies using hemagglutination inhibition(HI). The survey revealed that the overall seropositive rate was 29.86% (195/653). The distributions of anti-JEV seropositive rates in dogs were analyzed regarding different seasons, locations, living environments, ages or genders. The positive relationship between anti-JEV seropositive rate and epidemic season was revealed. The difference in seropositive rates were signifi cant (P ＜ 0.05) between locations and living environments but not significant between genders and ages (P ＞ 0.05). These findings indicated there was high prevalence of JEV infection in dogs in Shanghai, so it is necessary to monitor strictly and prevent JEV infection in dogs.

Japanese encephalitis; hemagglutination inhibition test; serological survey; dog

S852.659.6

A

1674-6422（2016）05-0006-04

2016-04-25

国家自然科学基金(31302116)；上海高校青年教师培养资助计划(ZZnlzl2003)；上海农林职业技术学院院级科研项目（091227）

钟登科，女，硕士，讲师，主要从事动物疫病研究

秦爱建，E-mail：aijian@yzu．edu．cn；魏建超，E-mail：jianchaowei@shvri．ac．cn