山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定

于可响，黄 兵，凌红丽，庞运倩，王友令，李 峰，亓丽红，宋敏训

（1.山东省农科院家禽研究所禽病研究中心 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛 266061）

山东省血清4型禽腺病毒的分离鉴定

于可响1，黄 兵1，凌红丽2，庞运倩1，王友令1，李 峰1，亓丽红1，宋敏训1

（1.山东省农科院家禽研究所禽病研究中心 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛 266061）

近期从山东省许多地区爆发的主要以心包积液为主要病变特征的发病鸡中分离到10株病毒，经PCR检测和血清型鉴定，确定为血清4型禽腺病毒。SPF鸡回归试验证实，分离到的病毒能完全复制出与临床相同的症状与病变。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用，制作的抗体也具有良好的治疗效果。

Ⅰ群禽腺病毒；血清4型；心包积液

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）根据抗原性差异可以分为3个群，其中Ⅰ群禽腺病毒又可分为12个血清型，能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。1987年在巴基斯坦安卡拉地区的肉鸡场爆发了一种以心包积液为特征的疾病，称为心包积液综合征，又称安卡拉病，该病后来蔓延至全国，给当地的肉鸡养殖业造成了极大的损失。随后心包液综合征在科威特、伊朗、日本、墨西哥等地相继发生。经研究证实，这些地区的心包积液综合征均由Ⅰ群禽腺病毒的血清4型引起[1-5]。近几年有研究人员从国内临床症状为包涵体肝炎和心包积液的发病鸡群中分离到了血清4型禽腺病毒[6]。

自2015年6月开始，山东省部分地区的817肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。随后该病传至山东省多个地区，感染宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种。

本研究从山东省不同地区不同品种的发病鸡中收集到20份病料，通过SPF鸡胚分离到10株病毒，SPF鸡回归试验发现，分离到的病毒能完全复制出与临床相同的症状。经阳性血清中和试验证实，该病是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型引起。灭活疫苗和抗体对该病能起到较好的预防和治疗作用。

1　材料与方法

1.1 发病情况 本病主要发生在10～30日龄的肉鸡、30～80日龄的蛋鸡、20～60日龄的麻鸡，具有发病急、死亡快、死亡率高的特点，若不采取有效的治疗措施，死亡率可达80%以上。该病传播较慢，病程较长，一般持续10 d以上，笼养蛋鸡传播更慢，有的可达30 d以上。发病鸡常常突然倒地不起，数分钟内死亡；有的出现精神沉郁，卧地不起，而后出现神经症状，随后很快死亡。死亡的鸡大多有严重的心包积液，呈透明的淡黄色或浅褐色，相当一部分死鸡肝脏肿大、出血或坏死，部分死鸡肾脏肿胀出血。

1.2 材料和试剂 采集20份发病鸡的肝脏、脾脏和法氏囊用于病毒分离检测；Ⅰ群禽腺病毒血清4型阳性血清由青岛农业大学尹燕博教授惠赠；SPF鸡胚、SPF鸡由山东昊泰实验动物繁育公司提供；817肉鸡购自高唐县某种鸡场；RNAiso Reagent、M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP、Taq酶购自TaKaRa（大连）公司；蛋白酶K、SDS、苯酚购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 病料检测 按照常规方法分别提取20份病料的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法进行新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性贫血病毒、网状内皮增殖症病毒、禽白血病病毒、Ⅰ群禽腺病毒等9种常见病毒的检测。

1.4 病毒分离 取无其他病毒混感的发病鸡的肝脏，加入5倍的体积生理盐水和终浓度为1000 U/mL的青链霉素，剪碎后充分研磨，然后分装，反复冻融3次，8000×g离心10 min，取上清经细菌检测无污染后，经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚（0．1 mL/枚），共6枚。收集接种后3～10 d内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，测定尿囊液的血凝价，并观察死胚的病变情况。

1.5 病毒鉴定

1.5.1 PCR鉴定 按照常规方法提取病毒DNA，利用PCR方法对Ⅰ群禽腺病毒进行检测。引物参照GenBank发表的禽腺病毒序列（登录号：HQ709226）进行设计。P1：5'-TTCGACCCCAT GACGCGCCAG G-3'；P2：5'-GCGAAAGGCGTA CGGAAGTAAGC-3'，预期扩增片段大小为503 bp，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

1.5.2 电镜观察 取有明显病变的鸡胚，研磨匀浆后冻融2次，然后3000×g离心20 min，上清液置于铜网上，2%磷钨酸负染1～2 min，利用透射电镜观察。

1.5.3 血清型鉴定 按照常规的血清中和试验方法[7]，利用Ⅰ群禽腺病毒阳性血清对分离到的10株病毒进行血清型鉴定。

1.6 SPF鸡回归试验 选取血清4型禽腺病毒YG8株，采用腿部肌肉注射的方式接种14日龄SPF鸡10只，每只接种的剂量为100ELD50，观察并记录实验鸡发病、死亡与病变情况。

采集病死鸡的肝脏，处理后接种6日龄SPF鸡胚，观察鸡胚死亡及病变情况，以确定是否能从实验鸡体内再次分离到病毒。

1.7 灭活疫苗免疫保护试验 将血清4型禽腺病毒YG8株的第10代鸡胚毒接种SPF鸡胚，收获24 h后死亡鸡胚的尿囊液和胚体，捣碎并冻融2次后，5000×g离心20 min，取上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，测定其ELD50；病毒上清用终浓度为1．2‰的甲醛灭活，按照水相:油相为1:3的比例制备成油乳剂疫苗。

7日龄SPF鸡随机分成两组。Ⅰ组为1次免疫攻毒组（n=8），疫苗通过皮下注射的方式免疫7日龄SPF鸡8只，0．2 mL/只，免疫后10 d进行攻毒，攻毒剂量为100ELD50，同时非免疫攻毒组（n=8）；Ⅱ组为2次免疫攻毒组，（n=8）疫苗通过皮下注射的方式免疫7日龄SPF鸡8只，0．2 mL/只，免疫后7 d进行二次免疫，0．4 mL/只，二次免疫后10 d对免疫实验鸡进行攻毒，攻毒剂量为100ELD50，同时各设非免疫攻毒组（n=8）。

1.8 抗体治疗试验 利用1．7中制备的灭活疫苗免疫230日龄的商品蛋鸡，免疫程序：首免0．5 mL/只，7 d后进行二免（0．8 mL/只），二免14 d后进行三免（1．0 mL/只）。收集三免后14～21 d的鸡蛋，蛋黄用氯仿处理后，利用鸡胚中和试验测定其中和效价。

40只18日龄的817肉鸡随机分成两组，每组20只。A组为攻毒治疗组，先采用肌肉注射的方式进行攻毒，每只攻毒剂量为100ELD50，当实验鸡开始出现症状时，进行抗体注射，每只0．5 mL；B组为攻毒对照组，只攻毒不治疗。观察记录实验鸡死亡情况直至攻毒后14 d。

2　结果

2.1 病料检测 从山东省不同地区不同品种发病鸡中收集到20份有严重心包积液的病料（图1），对这些病料进行了9种鸡常见病毒的检测。结果显示，20份病料Ⅰ群禽腺病毒均为阳性，10份混有传染性法氏囊病毒感染，6份混有传染性贫血病毒感染，2份混有H9亚型禽流感病毒感染，其中5份同时存在禽腺病毒、传染性法氏囊病毒和传染性贫血病毒感染。

图1　发病鸡心包积液情况Fig. 1 Pericardial effusion of infected chicken

2.2 病毒分离 将10份无其他病毒混合感染的病料接种6日龄SPF鸡胚，鸡胚大多在接种后5～8 d内死亡，胚体通身出血，部分胚体肝脏坏死。

2.3 病毒鉴定 利用PCR方法对通过鸡胚分离到的病毒进行Ⅰ群禽腺病毒检测，结果显示这10株病毒均为阳性（图2）。

图2　病毒分离株PCR检测结果Fig. 2 PCR result of virus isolated from SPF chicken embryo

通过电镜观察可以看到典型的腺病毒特征：球形、无囊膜、呈二十面体对称，直径约70～80 nm（图3）。利用Ⅰ群禽腺病毒阳性血清对分离到的10株病毒进行血清型鉴定，结果表明这10株病毒均为血清4型。

图3　病毒的电镜观察（40 000×）Fig. 3 Electron microscopic observation of the isolates (40 000×)

2.4SPF鸡回归试验 采用腿部肌肉注射途径接种14日龄SPF鸡，结果显示，接种后4 d攻毒组开始出现死亡，至20 d攻毒组共死亡6只，死亡率为60%，死亡鸡均有典型的心包积液和肝炎特征。

取病死鸡的肝脏处理后接种SPF鸡胚，结果鸡胚出现死亡，胚体出血，病变与病毒初次分离时一致，说明能从实验鸡体内重新复制出Ⅰ群禽腺病毒。

2.5 灭活疫苗免疫保护试验 用筛选的禽腺病毒制备灭活疫苗，免疫7日龄SPF鸡。攻毒保护试验表明，一次免疫（Ⅰ组）即可产生较好的保护，两次免疫（Ⅱ组）可以提供完全的保护（表1）。

表1　灭活疫苗免疫保护试验Table 1 The preventing test of inactivated vaccine

2.6 抗体治疗试验 用制备的疫苗免疫健康产蛋鸡，收集鸡蛋制作抗体，用于抗体治疗实验。结果治疗组（A组）仅1只死亡，对照组（B组）死亡11只（表2），说明抗体对该病具有良好的治疗作用。

表2　抗体治疗效果试验Table 2 Treatment effect of antibody

3　讨论

近几年来，Ⅰ群禽腺病毒病在山东省胶东地区大型肉鸡中一直呈散发性流行，主要是由血清2型8a型和8b型禽腺病毒引起，临床症状为以肝脏发黄、肿大、变脆等为主要病变特征的包涵体肝炎，较少出现心包积液[8]。病程较短，死亡率一般不会超过30%；817肉鸡、蛋鸡、麻鸡等发病较少。但本次调查研究显示，这次流行的禽腺病毒病是由血清4型病毒引起，主要侵害817肉鸡、蛋鸡、麻鸡，两者在血清型、发病宿主、病变特征、流行特点等方面存在很大的差别。

我们发现，临床上多数心包积液的病例并不单存在禽腺病毒的感染，而是同时存在传染性法氏囊病毒或传染性贫血病毒感染，甚至3种病毒的共同感染。有研究表明，传染性法氏囊病毒、传染性贫血病毒能增加Ⅰ群禽腺病毒的致病力，同时传染性法氏囊病毒本身就有很强的致死性，这些都是造成该病高发病率、高死亡率的原因。

疫苗免疫实验和抗体治疗实验结果表明，灭活疫苗具有良好的免疫保护作用，抗体具有很好的治疗效果。由于心包积液导致氧气供应不足是造成死亡的直接原因，因此降低饲养密度，增加正压通风，提供足够的氧气可以降低死亡率。从根本上预防本病，需要尽快研发相关疫苗进行免疫接种。同时本病能够通过垂直传播，防控本病还应从种鸡着手。

血清4型禽腺病毒为什么会突然大面积爆发？为什么发病宿主的范围突然扩大？是病毒变异造成的？还是疫苗污染引起的？这些问题还需要进一步研究。

[1] Saif Y M． 禽病学[M]． 苏敬良, 高福, 索勋, 译． 北京: 中国农业出版社, 2005．

[2] 何秀苗, 张科, 秦爱建, 等． Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株(FAVⅠ-JS) 的分离鉴定[J]． 中国预防兽医学报, 2005, 27(1) : 42-45．

[3] Domanska-Blicharz K, Tomczyk G, Smietankak K, et al．Molecular characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens with gizzard erosions[J]． Poult Sci, 2011, 90(5): 983-989．

[4] Monreal G． Adenoviruses and adeno-associated viruses of poultry[J]． Poultry Sci Rev, 1992, 4: 1-27．

[5] 罗思思, 谢芝勋, 邓显文, 等． Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析[J]． 畜牧与兽医, 2012, 44(1): 52-56．

[6] Zhao J, Zhong Q, Zhao Y, et al． Pathogenicity andcomplete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J]．PLoS One, 2015, 10(7): e0133073．

[7] 殷震, 刘景华． 动物病毒学[M]． 北京: 科技出版社, 1997．

[8] 李海英, 尹燕博, 郭妍妍, 等． 12株肉仔鸡包涵体肝炎病毒的分离和PCR鉴定[J]． 中国兽医科学, 2010, 40(7): 722-727．

CHARACTERIZATION OF SEROTYPE 4 FOWL ADENOVIRUS FROM SHANDONG

YU Ke-xiang1, HUANG Bing1, LING Hong-li2, PANG Yun-qian1, WANG You-ling1, LI Feng1, QI Li-hong1, SONG Min-xun1
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology, Poultry Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Qingdao Vland Biotech Inc. Qingdao 266061, China)

Ten virus isolates were obtained from the diseased chickens with pericardial effusion in Shandong province. These isolates were identifi ed as serotype 4 Fowl adenovirus through PCR detection and serotyping. The clinical signs and lesions were reproduced in SPF chickens via experimental infection with the isolated viruses. The inactivated vaccine prepared from the obtained isolate prevented the reoccurrence and injection of immune serum provided good therapeutic treatment for diseased chickens.

Fowl adenovirus; serotype 4; pericardial effusion

S852.659.1

A

1674-6422（2016）05-0001-05

2016-01-07

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队计划（SDAIT-13-011-01）；山东省海外高层次人才（泰山学者）引进计划；山东省2016年度农业重大应用技术创新项目；山东省重点研发计划“山东省血清4型禽腺病毒病流行病学及防控技术研究”

于可响，男，博士，副研究员，主要从事禽病研究

宋敏训，E-mail：mxsong@aliyun．com；亓丽红，E-mail：lwsdjn@163．com