蔗糖、碳粉对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

黄淑燕，郑郁善

（福建林业职业技术学院园林系，福建南平353000）

蔗糖、碳粉对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

黄淑燕，郑郁善

（福建林业职业技术学院园林系，福建南平353000）

生根培养阶段，添加不同浓度蔗糖及碳粉，置于黑暗及光照条件下分别培养，15d后观测记录不定根生长情况，30d后，观测根系生长情况并测定根系中次生代谢产物（甲素）含量。试验结果表明，黑暗条件下培养，生根率及最早生根时间均优于光照条件，而光照条件下根系增长量优于黑暗条件，40g·L-1蔗糖及0.5g·L-1碳粉（Ac）利于甲素含量的提高，而根系生长情况对甲素含量影响不明显。

蔗糖；碳粉；雷公藤；不定根生长；次生代谢产物含量

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）属于卫矛科（Celastrace ae）雷公藤属（Tripterygium）植物，又常称黄藤根、黄腊藤、水莽草、红药、断肠草、菜虫药等；多年生落叶蔓性灌木。雷公藤是我国传统的中药材，同时其次生代谢产物甲素具多方面的药用效果，因而近年来市场对其需求不断上升，导致野生雷公藤资源急剧减少，由于土地资源利用的局限性且自然条件下雷公藤生长周期长及甲素含量低等原因，使得其不能很好地满足市场的需求，所以寻找一种能够满足市场需求及提高雷公藤甲素含量的方法是当前科学研究是重要方向[1]。就目前来看，通过组织培养的方式来生产雷公藤的有用次生代谢产物，不仅能降低其生长周期，还能通过一定的方法提高其有用次生代谢产物含量，具重要实用价值[2-7]。

1 试验方法

1.1 试验材料

雷公藤组织培养生根阶段获得的无菌外植体。

1.2 雷公藤甲素提取工艺

将经组织培养获得的雷公藤完整植株经60℃烘干，精密称取2.0g，用研钵加少许78.64%的甲醇研碎，最后定容至0.072L，然后用聚乙烯膜封口，浸提12h，然后超声处理39min，过滤，残渣用甲醇冲洗2～3次每次0.01L，合并滤液，置于旋转蒸发仪中，在65℃水浴锅减压浓缩蒸去甲醇，待蒸至膏状时，将其移至分液漏斗中，加0.02L氯仿萃取，重复三次。合并萃取液，再次减压蒸去氯仿，待蒸干后，称取9g的中性氧化铝，用甲醇:乙酸乙酯:乙醚=1:2:1的洗脱液适量湿润后倒入中性氧化铝柱上（200目，1.6cm×20cm），用洗脱液分两次，每次0.04L洗脱，收集洗脱液并将其利用旋转蒸发仪蒸发至干燥状态，并将干状物质用色谱甲醇进行少量多次溶解，然后将其完全转移至0.01L比色管中，用色谱甲醇定容至0.01L处并摇匀，最后使用用0.45um滤膜过滤液体，转入样品瓶待测，每个样品三个重复[8]。

1.3 雷公藤甲素的HPLC测定

LCMS中LC的各项指标如下：

流速为0.001L·min-1；时间梯度为0.01s～10.00 min；B泵色谱甲醇比例48%；A泵水比例52%，10min停止本次样品工作，开始下一个样品进样。

LC冲洗梯度：0.01sB泵色谱甲醇比例10%，60 minB泵色谱甲醇比例90%，65min冲洗结束。

紫外灯检测器波长：218nm。

色谱柱柱温：40℃。

色谱柱型号：Sinoc Chrom ODS-BP5μm。

尺寸：4.6mm×150mm。

柱号：E1913672。

进样量：0.00002L。

1.4 雷公藤甲素标准曲线制作

利用天平准确量取雷公藤甲素标准品0.0124g，并用甲醇溶解且定容于0.025L容量瓶中，配成浓度为0.496g·L-1的雷公藤甲素标准液，再以次稀释成浓度为0.248、0.124、0.062、0.031、0.0155、0.00775g·L-1的雷公藤甲素标准液，制作标准曲线。

在上述色谱条件下，以对照品峰面积为横坐标，对照品浓度为纵坐标，绘制出标准曲线，雷公藤甲素在浓度0.00775～0.496g·L-1范围内线性关系良好，且成分之间分离清晰。回归方程为：y=0.0116x+1.3596，R2=0.99972

图1 甲素标样

1.5 试验方案

每种处理分为暗培养和光培养两种培养方式[5]。

1.5.1 蔗糖不同浓度添加对雷公藤组织培养不定根诱导及甲素含量的影响研究[9-11]

将蔗糖的添加浓度设定为0、20、30、40g·L-1，在配置培养基阶段按上述处理相应加入，经过高压灭菌后备用。培养15d后，观测不定根生长状况，培养30d后，测定其甲素含量。

1.5.2 碳粉不同浓度添加对雷公藤组织培养不定根诱导及甲素含量的影响研究[9-11]

将Ac的添加浓度设定为0、0.5、1.0、1.5g·L-1，在配置培养基阶段按上述处理相应加入，经过高压灭菌后备用。培养15d后，观测不定根生长状况，培养30d后，测定其甲素含量。

2 数据收集整理

生根率、平均根量的计算公式见式（1）、式（2）。

生根率（%）=生根总株数/接种总株数×100%（1）

平均根量（%）=根系总数/接种总株数×100%（2）

最早生根时间(d)：待外植体接入培养基中之日起，每天观察外植体生长状况，待第一条根系长出并记录即为最早生根时间。

最长根长（cm）：接种30d后，将每个处理的所有外植体从培养基中用镊子取出后，洗净根系上残留的培养基，用卷尺测量最长根系的长度即为最长根长。

3 结果与分析

表1 培养因子浓度水平

表2 不同培养基组合处理

表3 接种15d，不定根诱导结果分析

据表3统计结果显示：

（1）观察发现，黑暗条件下生根率明显高于光照条件下，原因在于在黑暗条件下，植物对营养物质的吸收加强，植物细胞内内源激素水平及激素间平衡的变化，导致了生根率的提高。这与Hammerschlag(1982)研究结果一致。黑暗条件下，所有处理平均根量均高于光照处理。因而，在生根培养前期，若进行1个星期左右黑暗处理，利于外植体的根系诱导。

（2）上述处理最早生根时间为9d，大部分出现在暗培养处理中，上述处理的最早生根时间，暗培养明显比光培养生根时间早，因而进一步验证了上述结论，处理7在黑暗与光照条件下的最早生根时间均是9d，因而对该种处理来说，黑暗及光照处理对根系诱导在出现的时间上无太大区别。

（3）外植体根系长度并无一定规律性，因而只能认为根系长度可能与外植体的生长状况相关，平均根长长表明外植体生长状况良好，利于外植体纵向生长，根系短表明外植体生长较弱，但其不能被采用来判定某处理是否为最佳生根方案。

表4 接种30d，不定根诱导及甲素含量结果分析

据表4统计结果显示：

（1）接种30d后，光照或黑暗条件下培养，生根率均达100%。因而，上述基本培养基处理，均适宜雷公藤生根培养。

（2）对试验获得数据进行分析可知，与接种15d相比，所有处理的平均根量均提升1～2倍，但总体而言，光照条件下平均根量增长更快，黑暗条件下增长较慢，同时在该阶段，光照条件下平均根量多于黑暗条件。因而，在雷公藤生根培养的阶段中，1个星期左右的暗培养利于根系诱导，若暗培养时间延长，则根系诱导受到抑制，可能原因是根系诱导无需消耗太多营养物质，一个星期的暗培养阻断了一些营养物质的大量供给，但当根系诱导之后，根系需要吸收一定的营养物质方能维持正常的生长增殖，若一直处于黑暗条件下，则营养供应不足，根系诱导便受到抑制。因而生根培养最佳的培养方式为在接种后进行1个星期左右暗培养，然后将其转至光照条件下培养，这样便可获得更多根量。

（3）最长根长与营养物质吸收状况及外植体的生长状况相关，上述试验结果表明，培养30d后，根系长度有所延长，但无一定规律性，表3亦表明，甲素含量不随根系长度延长而增加。因而，根系长短并不能作为判定其是否利于根系诱导及甲素含量提高的依据。

（4）试验结果表明，所有处理光照条件下甲素含量低于黑暗条件，但处理7（蔗糖40g·L-1，Ac0.5g·L-1）在光照或是黑暗条件均获得了最高的甲素含量，即光照条件下18.07μg·gFW-1，黑暗条件下26.26μg·gFW-1。综上所述，黑暗条件下利于雷公藤甲素的合成；暗培养环境，处理7甲素含量最高。（详见图2、图3）。

（5）表4表明，以蔗糖浓度为计算基准，不论Ac使用浓度多少，不论培养条件是黑暗或光照，40g·L-1的蔗糖浓度可获得最大甲素含量，20g·L-1及30g·L-1的蔗糖含量，甲素含量相差不多；对于Ac使用浓度试验结果，0.5g·L-1为最佳使用浓度。

图2 光照条件下蔗糖、Ac添加对不定根诱导甲素含量影响

图3 黑暗条件下蔗糖、Ac添加对不定根诱导甲素含量影响

4 结论

在基本培养基培养因子不同浓度添加对雷公藤不定根诱导及甲素含量影响研究试验中得出：不论培养因子使用浓度多少，其对雷公藤的生根率均没有显著影响作用，培养30 d后，雷公藤不定根生长均能达100%，但对于甲素含量，40 g·L-1蔗糖及0.5 g·L-1碳粉（Ac）组合的浓度使用能取得较好试验效果。本试验结果亦得出，雷公藤不定根接种后，1个星期暗培养后，转至光照培养，可令雷公藤在根系生长阶段根量增加，且根系生长状况得到提高。

[1]尹作鸿,朱蔚华,于德全.雷公藤组织培养物中化学成分的研究[J].天然产物研究与开发,1991,3(2):46-51.

[2]王丹,王振月,王宗权,等.药用植物次生代谢产物生产途径的研究概述[J].中医药信息,2008(1):29-32.

[3]李永丽,周洲,李科友.细胞培养生产药用次生代谢物研究进展[J].安徽农业科学,2006,34(2):219-221.

[4]张康健.药用植物次生代谢[M].西安:西北大学出版社, 2001：44-49.

[5]黄淑燕,雷公藤组织培养机理及次生代谢产物含量研究[D].福州:福建农林大学,2012.

[6]孙立影,于志晶,李海云,等.植物次生代谢物研究进展[J].吉林农业科学,2009(4):4-10.

[7]王莉,史玲玲,张艳霞,等.植物次生代谢物途径及其研究进展[J].武汉植物学研究,2007(5):500-508.

[8]周维燕.植物细胞工程原理与技术[M].北京:中国农业大学出版社,2001：62.

[9]吴少辉,刘光明.雷公藤内酯的提取、分析和药理作用研究进展[J].现代药物与临床,2011(1):36-39.

[10]李琰,杨广隶,冯俊涛,等.碳源及植物生长调节剂对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响[J].林业科学, 2010(9):224-228.

[11]李琰,冯俊涛,王永宏.培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响[J].林业科学,2010(5)：64-69.

（责任编辑：陈果）

An Effect on the Adventitious Root Grow th and Secondary M etabolite Content of Tripterygium Wilfordii for the Sucrose Toner

HUANG Shuyan，ZHENG Yushan
（Department of Landscape Architecture，Fujian Forestry Vocational Technical College，Nanping,Fujian 353000)

In the rooting culture stage of Tripterygium Wilfordii,adding different concentrations of sucrose and carbon,under dark and light conditions respectively.The root growth of adventitious root was recorded after 15d.After 30d,the root growth was observed and the contents of secondary metabolites were measured.The experiment results showed that the cultivation of the light condition was better than the condition in the dark for the rooting rate and rooting time.But under the light condition,the root growth was better than that of the dark.40 g·L-1sucrose and 0.5 g·L-1carbon were in favor of the increase for the content of the secondary metabolites,but the effect of root growth was not obvious.

sucrose；toner;tripterygium wilfordii;adventitious root growth;secondary metabolite content

S567.19

A

1674－2109(2016)09－0025－04

2016-01-15

国家科技支撑计划(2009BAI73B01)；福建省科技重大专项(2004YZ02-05)；福建省科技创新平台(2008Y2001)。

黄淑燕(1986-),女,汉族，助教,主要从事园林植物组织培养和中药材GAP研究。

郑郁善(1960-),男,汉族,教授,博士生导师,主要从事森林培育学和中药材研究。