青葙子提取物对小鼠糖尿病视网膜病血—视网膜屏障的保护作用及机制

郭树鹏++++++杨进花++++++赵辉++++++余增洋

[摘要] 目的 观察青葙子提取物（CAE）对链脲佐菌素（STZ）诱导的C57小鼠糖尿病视网膜病（DR）血-视网膜屏障（BRB）的改善作用，并进一步研究其可能机制。 方法 采用STZ诱导C57小鼠建立DR模型，然后给予DR小鼠CAE 100 mg/kg干预；通过检测视网膜组织白蛋白（Albumin）渗漏和血管内皮生长因子（VEGF）表达观察CAE对DR小鼠BRB破坏的影响；采用Western blot检测视网膜组织Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1及p-NFκB、IκB、p-IKK的蛋白表达水平；采用ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。 结果 CAE能够逆转DR小鼠视网膜组织Albumin渗漏增加和VEGF表达的升高（P < 0.01）；CAE能够上调DR小鼠视网膜组织降低的紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-5、Occludin表达（P < 0.05或P < 0.01），同时能够抑制NFκB信号通路的激活（P < 0.01），并下调DR小鼠血清中增加的IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P < 0.01）。 结论 CAE具有保护STZ诱导DR小鼠BRB的活性，其机制为保护DR中减少的紧密连接蛋白表达，同时抑制了DR中炎性信号通路的激活。

[关键词] 糖尿病视网膜病；青葙子；血-视网膜屏障；紧密连接蛋白；炎性信号

[中图分类号] R774.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the amelioration of Celosia argentea L. extract （CAE） on the blood-retina barrier （BRB） of streptozotocin （STZ）-induced diabetic retinopathy （DR）， and to study its possible mechanism. Methods DR was induced by STZ injection in C57 mice and then the DR mice were given with 100 mg/kg CAE. The BRB breakdown was evaluated by the expression of Albumin leakage and VEGF. The levles of Claudin-1， Claudin-5， Occludin， ZO-1， p-NFкB， IκB and p-IKK were detected by Western blot. The levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum were quanlified by ELISA. Results The increased retinal Albumin leakage and VEGF expression were reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. The reduced retinal tight junction protein expressions of Claudin-1， Claudin-5 and Occludin were enhanced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.05 or P < 0.01）. The activation of NFкB signal pathway was inhibited by CAE and further the increased serum TNF-α， IL-1β and IL-6 amount was reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. Conclusion CAE ameliorates DR via improving BRB breakdown by attenuating inflammation and enhancing the retinal tight junction protein expression.

[Key words] Diabetic retinopathy； Celosia argentea L.； Blood-retina barrie； Tight junction protein； Inflammatory signal

糖尿病视网膜病（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病严重的并发症之一，已日渐成为影响成年人视力健康的最主要疾病。临床上根据DR的发病进展，分为早期的非增殖性糖尿病视网膜病（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和后期的增殖性糖尿病视网膜病（proliferative diabetic retinopathy，PDR）[1]。早期NPDR阶段的显著标志是血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破坏和渗出增加，造成缺血缺氧状态，若得不到缓解，将进展到后期的PDR阶段，出现视网膜血管病理性增生，导致视力严重损害甚至失明[2-3]。

青葙子是传统明目中药，具有清热泻火、明目退翳的功效，临床上常用于治疗肝热目赤、眼生翳膜、视物昏花等。本研究在建立小鼠早期NPDR模型基础上，观察了青葙子提取物（Celosia argentea L. extract，CAE）对BRB破坏的保护作用，进一步从CAE对NPDR小鼠紧密连接蛋白表达和炎症信号通路的影响两方面探讨了CAE保护BRB的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物

青葙子（Celosia argentea L.），经上海市宝山区中西医结合医院药剂科熊波中药师鉴定为苋科青葙属青葙的干燥成熟种子。将青葙子药材于60℃干燥12 h，粉碎后过40目筛，称取50 g加入500 mL稀乙醇室温条件浸渍24 h，时时摇动，抽提2次，过滤，合并滤液，减压浓缩除去溶剂，得到提取物浸膏。称取适量浸膏，加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）研磨溶解，配成给药溶液。

1.2 动物

SPF级健康雄性C57小鼠，5周龄，体重18～22 g，购自中科院上海实验动物中心。饲养于上海中医药大学附属岳阳医院吴泾分院实验动物中心，12 h光暗循环，饲料与水消毒后自由摄取，适应性饲养1周后使用。

1.3 试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司；柠檬酸、柠檬酸三钠、多聚甲醛均购自国药试剂；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA Kits均购自RapidBio公司；BCA Protein Assay Kit购自Thermo Scientific公司；ECL化学发光显影液购自Millipore公司；本实验所用抗体均购自CST公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物实验 称取适量STZ粉末避光溶解于缓冲液中，在1 h内立即给予已禁食过夜的小鼠腹腔注射，终剂量为55 mg/kg。连续5 d腹腔注射造模。正常小鼠给予相同体积缓冲液做为对照。末次造模1周后尾静脉采血测血糖，血糖值高于16.7 mmol/L被认为糖尿病造模成功，然后随机分为两组：模型组和CAE组。CAE组小鼠2个月后开始予CAE灌胃给药，最终给药剂量为100 mg/kg，连续给药30 d。每月监测血糖和体重。给药结束后用乌拉坦麻醉小鼠，腹主动脉取血，立即摘取眼球，用于后续实验。

1.4.2 小鼠视网膜组织Albumin渗漏检测 小鼠左心室盥洗生理盐水（37℃）以彻底清除体循环中血液，然后摘取双侧眼球进行Albumin渗漏检测。

1.4.3 Western blot检测视网膜组织相关蛋白表达 摘取小鼠眼球，于解剖显微镜下取出视网膜组织，加入lysis buffer于冰上超声匀浆，匀浆液用低温离心机（型号：5810R，Eppendorf公司）以10 000 r/min离心10 min，取出上清，蛋白定量，上样，转膜，封闭，加入一抗于4℃慢摇孵育过夜，用1×TBST洗3次后，与二抗室温慢摇孵育1 h，用1×TBST洗3次后，加入ECL化学发光液反应1 min，置于凝胶成像系统拍照。

1.4.4 小鼠血清中炎症细胞因子检测 取小鼠血浆以2000 r/min离心10 min，移取上清即得血清，采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体重及血糖水平比较

由表1可见，C57糖尿病造模小鼠从第13天开始血糖值均高于16.7 mmol/L且维持稳定，与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），CAE给药对血糖没有影响。从表2可见C57糖尿病造模小鼠体重明显低于正常小鼠（P < 0.01），CAE给药对体重增加没有影响。从血糖和体重结果可以看出糖尿病造模成功，同时CAE未见对糖尿病状态有影响。

2.2 CAE对DR小鼠视网膜组织BRB破坏的影响

由图1和表3可见，与正常组相比，模型组小鼠视网膜组织Albumin渗漏和VEGFA蛋白表达均增加（P < 0.01），而CAE 100 mg/kg能够抑制DR小鼠视网膜组织增加的Albumin渗漏和VEGF蛋白表达（P < 0.01）。

2.3 CAE对DR小鼠视网膜组织紧密连接蛋白的影响

由图2和表4可见，与正常组相比，模型组小鼠视网膜组织Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表达均降低（P < 0.01），而CAE能够上调DR小鼠视网膜Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表达（P < 0.05或P < 0.01），但对ZO-1未有影响（P > 0.05）。

2.4 CAE对DR小鼠视网膜组织NFкB信号通路的影响

由图3和表5可见，与正常组相比，模型组小鼠视网膜炎性通路p-NFкB、p-IKK蛋白表达增加，IкB蛋白表达降低（P < 0.01），说明DR模型小鼠NFкB通路激活，而给予CAE后可以抑制上述过程（P < 0.01）。

2.5 CAE对DR小鼠血清中炎症细胞因子水平的影响

由表6可见，DM小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量同正常组小鼠相比显著增加（P < 0.01），而CAE可以降低DM小鼠炎症因子的含量（P < 0.01）。

3 讨论

DR早期NPDR阶段的显著标志是BRB的破坏和血管渗漏增加，BRB在调节血管通透性、神经-视网膜组织营养物质输送和供氧中有重要作用[4-6]。Albumin是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%～60%，细胞外液中仅有极微量的存在。VEGF在促进血管新生和血管通透性方面均有十分重要的作用[7-10]。本研究通过检测视网膜组织Albumin渗漏和VEGF表达水平反映BRB的破坏情况。结果显示，CAE均能够减少DR小鼠视网膜组织增加的Albumin渗漏和VEGF表达，说明CAE具有保护DR小鼠视网膜BRB的药效活性。

血管内皮细胞间存在的紧密连接蛋白在调节血管内皮细胞间通透性、维持BRB完整性中发挥重要作用[11-13]。已有报道显示，Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1在DR中表达降低[14-15]。本研究结果显示，CAE能够逆转DR小鼠视网膜组织减少的Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表达，而对ZO-1未有明显影响。结果说明CAE可能通过保护Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表达进而保护DR小鼠视网膜BRB。

已有研究认为在糖尿病状态下，许多炎症因子水平升高，参与了BRB的炎性破坏[16-17]。NFкB信号通路是经典的炎症通路，调控许多炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的释放[18-20]。本研究结果显示，CAE能够抑制DR小鼠NFкB信号通路的激活，同时降低DR小鼠血清中增加的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。结果提示，CAE能够抑制DR小鼠炎症信号通路的激活和炎症因子的释放。

综上所述，本研究发现CAE具有改善STZ诱导小鼠DR的药效活性，其机制为CAE通过抑制DR小鼠炎症水平，增加视网膜组织紧密连接蛋白表达，保护视网膜BRB，进而发挥改善小鼠DR的药效活性。本研究结果提示CAE有望成为治疗DR的潜在有效药物。

[参考文献]

[1] Frank RN. Diabetic Retinopathy[J]. N Engl J Med，2004， 350（1）：48-58.

[2] Shin ES，Sorenson CM，Sheibani N. Diabetes and retinal vascular dysfunction [J]. J Ophthalmic Vis Res，2014，9（3）：362-373.

[3] Kollias AN，Ulbig MW. Diabetic retinopathy： Early diagnosis and effective treatment [J]. Dtsch Arztebl Int，2010， 7（5）：75-83.

[4] Zhang C，Wang H，Nie J，et al. Protective factors in diabetic retinopathy：focus on blood-retinal barrier [J]. Discov Med，2014，18（98）：105-112.

[5] Tzeng TF，Hong TY，Tzeng YC，et al. Consumption of Polyphenol-Rich Zingiber Zerumbet Rhizome Extracts Protects against the Breakdown of the Blood-Retinal Barrier and Retinal Inflammation Induced by Diabetes [J]. Journal of Submicroscopic Cytology & Pathology，2014，7（9）：7821-7841.

[6] Cunha-Vaz J，Bernardes R，Lobo C. Blood-retinal barrier [J]. Eur J Ophthalmol，2011，21（Suppl 6）：S3-9.

[7] Ferrara N. Vascular endothelial growth factor：basic science and clinical progress [J]. Endocr Rev，2004，25（4）：581-611.

[8] Qaum T，Xu Q，Joussen AM，et al. VEGF-initiated blood-retinal barrier breakdown in early diabetes [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42（10）：2408-2413.

[9] Fogli S，Mogavero S，Egan CG，et al. Pathophysiology and pharmacological targets of VEGF in diabetic macular edema [J]. Pharmacological Research，2015，103：149-157.

[10] Boyer DS，Hopkins JJ，Sorof J，et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for diabetic macular edema [J]. Ophthalmology，2013，4（6）：151-169.

[11] Vandenbroucke E，Mehta D，Minshall R，et al. Regulation of Endothelial Junctional Permeability [J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1123（1）：134-145.

[12] Erickson KK，Sundstrom JM，Antonetti DA. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions [J]. Angiogenesis，2007，10（2）：103-117.

[13] Harhaj NS，Antonetti DA. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology [J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2004， 36（7）：1206-1237.

[14] Bucolo C，Ward KW，Mazzon E，et al. Protective effects of a coumarin derivative in diabetic rats [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50（8）：3846-3852.

[15] Leal EC，Martins J，Voabil P，et al. Calcium dobesilate inhibits the alterations in tight junction proteins and leukocyte adhesion to retinal endothelial cells induced by diabetes [J]. Diabetes，2010，59（10）：2637-2645.

[16] Bertoni AG，Burke GL，Owusu JA，et al. Inflammation and the incidence of type 2 diabetes：the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis（MESA）[J]. Diabetes Care，2010，33（4）：804-810.

[17] Adamis AP，Berman AJ. Immunological mechanisms in the pathogenesis of diabetic retinopathy [J]. Seminars in Immunopathology，2008，30（2）：65-84.

[18] Becker-Weimann S，Xiong G，Furuta S，et al. NFкB disrupts tissue polarity in 3D by preventing integration of microenvironmental signals [J]. Oncotarget，2013，4（11）：2010-2020.

[19] Debelec-Butuner B，Alapinar C，Varisli L. Inflammation-mediated abrogation of androgen signaling：an in vitro model of prostate cell inflammation [J]. Mol Carcinog，2014， 53（2）：85-97.

[20] Leychenko A，Konorev E，Jijiwa M，et al. Stretch-induced hypertrophy activates NFкB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes [J]. PLoS One，2011，6（12）：e29055.