基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响

魏洪吉

【摘要】 目的 探讨基因沉默整合素连接酶（ILK）对胰腺癌细胞（Panc-1）上皮向间质转化（EMT）的影响。方法 培养Panc-1细胞， 构建ILK-specific-shRNA慢病毒载体后， 再行转染Panc-1细胞， 通过Western-blot技术验证感染基因的有效性， 同时比较Panc-1细胞上皮向EMT转化标志性蛋白E-钙连蛋白（E-cadherin）表达情况。结果 ①基因沉默ILK明显的抑制了Panc-1细胞的迁移、侵袭能力， 且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为（0.15±0.03）， 明显低于阴性组（0.43±0.02）， 差异具有统计学意义（t=23.572， P<0.01）。②SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电脉法（SDS-PAGE）结果：E-cadherin的条带为122～141 KD， GAPDH为37 KD的条带。siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达为（0.545±0.011）， 明显高于阴性组（0.079±0.004）， 差异有统计学意义（t=28.942， P<0.01）。结论 基因沉默ILK转染后， 明显抑制Panc-1细胞迁移、侵袭能力， 显著上调E-cadherin 表达， 逆转了EMT 的发生。

【关键词】 基因沉默；整合素连接酶；胰腺癌细胞；上皮向间质转化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194

胰腺癌发病率占常见恶性肿瘤的1%～2%， 死亡率高[1]。由于多数患者在确诊时己发生癌细胞转移， 无法进行胰腺切除手术， 只能采用化疗、放疗等姑息治疗手段， 随之产生的副作用严重降低了患者的生活质量。寻找新的治疗思路迫在眉睫。ILK是一种细胞内信号蛋白， 是多种致瘤相关因素的上游交叉点， 与肿瘤的形成、增殖、凋亡、转化和侵袭转移密切相关[2]。因此， 研究ILK对胰腺癌细胞EMT的影响可能是一种新的治疗思路。

1 材料与方法

1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1细胞株购自中国科学院细胞库；兔E-cadherin抗体、ILK多克隆抗体、BCA蛋白定量试剂盒、增强化学发光试剂、PVDF膜等购自武汉博士德生物工程有限公司；低温高速离心机购自德国Heraeus公司产品；转膜电泳槽购自美国 Bio-Rad 公司；PCR仪（PE2400）购自美国Perking Elmer公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒载体的构建 针对目的基因序列， 采用siSearch和sFold两种在线设计软件设计核苷酸序列[3]。将自行合成的含干扰序列的双链DNAoligo两端含酶切位点的粘端连入酶切后的RNA干扰载体上， 再转入制备好的细菌感受态细胞， 对长出的克隆先进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定， 测序比对， 鉴定阳性即构建成功。

1. 2. 2 感受态细胞的制备转染 人胰腺癌Panc-1细胞株常规接种于高糖杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）培养液中[4]（含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）， 于5%二氧化碳饱和湿度、37℃条件下培养， 每2天换液1次。将一个上述培养基中的单菌落转到SOB培养基中， 37℃剧烈振摇3 h， 然后转移到无菌预冷的丙烯管中， 冷却至0℃， 以4000 r/min离心10 min回收细胞。以0.1 mol/L CaCl2重悬， 4℃下， 4000 r/min离心10 min回收细胞， 连接反应制备克隆连接液， 转化。正常目的细胞在6孔板上分为三组：①空白组：未感染任何病毒；②阴性组：加阴性对照病毒感染；③阳性组：加RNAi靶点病毒感染。感染4 d后行PCR检测。

1. 2. 3 Western blot 检测 提取目的细胞中的蛋白， 蛋白定量法（BCA法）对蛋白进行定量测定。再取适量蛋白样品， 95℃加热变性， 以SDS-PAGE分离， 每孔上样量为100 μg。常规处理后转至PVDF膜， 5%脱脂牛奶封闭40 min， 倒掉封闭液， 加一抗4℃孵育过夜， TBST洗膜3次， 分别加入相应的二抗孵育1 h后TBST洗膜3次， 最后化学发光法显影， 暗室曝光， 使用凝胶扫描仪扫描分析， 以Quantity One软件对条带进行分析。

1. 2. 4 细胞迁移与侵袭实验 细胞侵袭实验操作如下：镊子经乙醇消毒后， 置于培养箱中达到室温， 然后以其处理侵袭室内的嵌入物， 加入300 μl无血清培养基。各组细胞以无血清培养基重悬， 以血球计数板计数， 调整细胞密度约为5×108个。取200 μl细胞悬液加入侵袭室上室嵌入物， 下室加入500 μl 胎牛血清（FBS）高于侵袭室的培养基， 于组织培养箱中培养2～3 d。去除培养基， 以棉拭子拭去非侵袭细胞， 于每孔嵌入物中加入500 μl染色液染色， 浸泡20 min， 再反复冲洗， 空气中晾干， 以10%醋酸溶解， A570检测。细胞迁移实验步骤同侵袭实验， 但下室所加FBS浓度为30%。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 siRNA慢病毒转染对Panc-1迁移和侵袭的影响 基因沉默ILK明显的抑制了Panc-1细胞的迁移、侵袭能力， 且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为（0.15±0.03）， 明显低于阴性组（0.43±0.02）， 差异具有统计学意义（t=23.572， P<0.01）。

2. 2 siRNA 慢病毒转染 Panc-1 细胞后E-cadherin 表达情况 SDS-PAGE结果：E-cadherin的条带为122～141 KD， GAPDH为37 KD的条带。siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达为（0.545±0.011）， 明显高于阴性组（0.079±0.004）， 差异有统计学意义（t=28.942， P<0.01）。

3 讨论

胰腺癌是预后较差的恶性肿瘤之一， 由于胰腺癌早期诊断困难， 且易发生血液或淋巴转移， 一般确诊后生存期平均≤6个月， 5年内生存率<5%[5]， 给社会和患者家庭造成极大负担。癌细胞侵袭和转移是目前临床研究的热点。ILK作为整合素和生长因子受体信号转导途径中的一个重要效应物， 调节着细胞的豁附、生存、分化和凋亡， 对肿瘤的发展、转移及预后等发挥着重要作用[6]。庄翔等[7]研究显示， ILK在人类神经源性肿瘤、胃癌、卵巢肿瘤、黑色素瘤、肺癌中ILK表达明显增高。上皮向间质转化是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。正常情况下EMT的发生受到严密调控， 但肿瘤发展过程中， EMT是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要途径。ILK作为EMT的诱导因子， 在肿瘤侵袭转移过程中有与癌基因类似的效应， 因此有效的抑制ILK的表达或降低其生物学活性是抗肿瘤治疗的关键。E-cadherin为EMT的标志性蛋白， ILK的过度表达则会导致E-cadherin的减少或缺失， 检测E-cadherin 蛋白表达情况可反映ILK对EMT的影响。

研究显示， 基因沉默ILK明显的抑制了Panc-1细胞的迁移、侵袭能力， 且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为（0.15±0.03）， 明显低于阴性组（0.43±0.02）， 差异具有统计学意义（t=23.572， P<0.01）。同时， SDS-PAGE结果显示：E-cadherin的条带为122～141 KD， GAPDH为37 KD的条带。siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达为（0.545±0.011）， 明显高于阴性组（0.079±0.004）（t=28.942， P<0.01）。表明ILK可通过抑制Panc-1细胞迁移、侵袭能力、上调E-cadherin 表达抑制EMT发生， 可作为胰腺癌临床治疗的重要思路。

综上所述， 基因沉默ILK可明显抑制Panc-1细胞迁移、侵袭能力， 上调E-cadherin 表达， 逆转EMT 的发生。

参考文献

[1] 常志刚， 韦军民， 秦昌富， 等. 靶向抑制表皮生长因子受体对胰腺癌细胞上皮-间质转化的影响及机制. 中华实验外科杂志， 2013， 30（1）：13-16.

[2] 李晓红， 陆晶晶， 朱慧， 等. 抑制微小RNA-200a表达对胰腺癌上皮-间充质转化过程的影响. 中华实验外科杂志， 2014， 31（10）：2178-2181.

[3] 谢传高， 魏树梅， 陈清宇， 等. GEP100基因沉默抑制胰腺癌细胞AsPC-1的侵袭能力. 中国病理生理杂志， 2010， 26（7）：1348-1351.

[4] Bradford JW， Baldwin AS. Chapter Three-IKK/Nuclear Factor-kappaB and Oncogenesis： Roles in Tumor-Initiating Cells and in the Tumor Microenvironment. Advances in Cancer Research， 2014， 121（121）：125-145.

[5] 黄陈， 张坤东， 吴卫东， 等. Caveolin-1与胰腺癌上皮间质转化及转移关系的研究. 中华普通外科杂志， 2014， 29（7）：545-547.

[6] 黄懿， 韶云鹏， 丁留成， 等. 过表达整合素连接酶基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞的研究. 中华实验外科杂志， 2014， 31（6）：1373.

[7] 庄翔， 朱军， 吕梦欣， 等. 特异性ILK siRNA对膀胱癌EJ细胞EMT及移植瘤生长的影响. 基础医学与临床， 2016， 36（2）：191-198.

[收稿日期：2016-07-26]