基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫抗体Dot—ELISA检测方法的建立

姜鑫 李新 侯洪烈 高珺珊 宫鹏涛 李建华 杨举 张西臣

摘 要：以建立Dot-ELISA检测犬心丝虫血清抗体的方法，用纯化的犬心丝虫MTFP基因蛋白为包被抗原，进行条件优化，筛选最佳反应条件，并进行敏感性、重复性和特异性等试验。结果表明，建立的犬心丝虫Dot-ELISA检测方法最佳抗原包被浓度为0.5 μg·片-1；待检样品血清最佳稀释比例为1∶50；HRP标记兔抗犬抗体最佳稀释比例为1∶4 000；建立的Dot-ELISA方法敏感性为1∶200；批间重复试验证明，该方法具有良好的重复性，且与犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清没有交叉反应；利用建立的方法对吉林省某地的62份待检血清进行检测，结果阳性率为4.8%。研究成功建立了基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫Dot-ELISA检测血清抗体方法，为犬心丝虫病流行病学调查和临床诊断提供了新技术。

关键词：犬心丝虫；Dot-ELISA；MTFP蛋白

中图分类号：R383.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.023

Abstract：To establish Dot-ELISA for detection infection by Dirofilaria immitis in dogs， the optimum reaction conditions was optimized with purified MTFP protein of Dirofilaria immitis as coating antigen， and the sensitivity， repetition and specificity were tested. The results showed that the optimum reaction conditions of established Dot-ELISA was 0.5 μg·tablet-1 for coated concentration， 1∶50 for the serum samples and 1∶4 000 for rabbit anti canine antibody labeled by HRP. The sensitivity of Dot-ELISA was 1∶200. The repeat test showed that the method had a good repeatability. There were no cross reaction with positive serum of Isospora spp and Toxocara canis. The detected results of 62 samples came from Jilin province showed the positive rate was 4.8% by the established method. The Dot-ELISA for detection on infection by Dirofilaria immitis in dogs based on recombinant MTFP protein had successfully established. It provided a new technology for pidemiological survey and clinical diagnosis of canine dirofilariasis.

Key words： Dirofilaria immitis；Dot-ELISA；MTFP

犬心丝虫（Dirofilaria immitis）是一种通过蚊子传播的线虫，成虫寄生在犬的右心室及肺动脉内，会造成犬心脏的机械性栓塞，导致心肺机能下降及全身各系统的功能衰竭，最终导致患犬死亡[1-5]。目前对犬心丝虫病的临床检查主要有：胸透摄影检查法、心脏彩超检查法等。实验室检查方法主要有血液虫检法、凝集试验法、免疫印迹法等。但这些方法在实际应用过程中存在的问题是检测的灵敏度低，尤其是对尚未发病的隐性感染患犬检出率低[6-10]。因此，建立切实可行的检测犬心丝虫的方法显得尤为重要。

本研究利用吉林大学动物寄生虫学实验室制备的犬心丝虫pet-28a-MTFP表达菌纯化得到犬心丝虫MTFP蛋白，以其作为包被抗原，建立一种Dot-ELISA检测犬心丝虫血清抗体的方法，旨在为犬心丝虫病的流行病学调查和临床诊断提供一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 血清 自然感染犬心丝虫病犬阳性血清及健康犬的阴性血清、犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清、犬心丝虫pet-28a-MTFP表达菌均由吉林大学动物寄生虫学实验室提供。

1.1.2 包被抗原 犬心丝虫pet-28a-MTFP表达菌经表达纯化得到犬心丝虫MTFP蛋白，作为包被抗原。

1.1.3 Dot-ELISA所用试剂 包被液CBS（碳酸盐缓冲液），用氢氧化钠调pH值至9.6，4 ℃冰箱保存；洗涤液PBST（1 LPBS+0.5 mL Tween20）；封闭液（PBST稀释的5%的脱脂奶粉溶液）。DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；HRP标记的兔抗犬IgG，购自北京博奥森公司；硝酸纤维素膜（NC膜），购自美国Millipore公司。

1.2 方 法

1.2.1 Dot-ELISA操作步骤 取适当大小的NC膜，在盛有双蒸水的平皿中浸泡20 min，使膜活化后取出至室温干燥。将干燥好的膜片用4 mm直径的打孔器打成圓形的小膜片，用镊子将其放于96孔ELISA板内。将稀释好的抗原取2 μL点于除空白对照的每一个膜片的正中央，室温晾干。膜片干燥后，将封闭液用排枪加于96孔板中，37 ℃封闭60 min，弃孔液，用PBST洗涤3次。每孔加入50 μL稀释的被检血清，37 ℃反应60 min，弃孔液，用PBST洗涤3次。每孔加入50 μL酶标二抗稀释液，37 ℃反应60 min。弃孔液，用PBST洗涤3次。每孔加入50 μL DAB显色液，置于避光处反应10～15 min，待显色后每孔加入100 μL双蒸水终止反应。

1.2.2 结果判定 根据是否发生显色以及显色深浅来判定：膜片呈深褐色为强阳性（++++）膜片呈棕色判定为较强阳性 （+++）；膜片呈浅棕色判定为阳性 （++）；着色淡，与背景反差小者为弱阳性 （+）；未显色者为阴性（-）。

1.2.3 最适包被抗原稀释浓度的确定 将纯化的MTFP蛋白用缓冲液对抗原按照1，0.5，0.25， 0.125，0 μg·片-1稀釋，放置在室温使其干燥，从而确定Dot-ELISA的最佳抗原包被浓度。

1.2.4 最佳待检血清稀释浓度的确定 将2 μL MTFP蛋白稀释液包被在NC膜上，用洗涤液PBST将自然感染的犬心丝虫阳性血清按照1∶10，1∶50， 1∶100， 1∶200， 1∶400的比例稀释，加入NC膜所在孔内50 μL·孔-1，分别进行Dot-ELISA，观察显色，从而确定Dot-ELISA待检血清最佳稀释倍数。

1.2.5 最适酶标二抗稀释浓度的确定 将HRP标记的兔抗犬抗体用洗涤液PBST按照1∶1 000， 1∶2 000，1∶4 000， 1∶8 000，1∶16 000比例稀释，分别进行Dot-ELISA，观察显色变化，从而确定Dot-ELISA酶标二抗最佳稀释倍数。

1.2.6 敏感性试验 取犬心丝虫阳性血清，按照1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600的比例稀释，确定其敏感性。

1.2.7 重复性试验 选取3份犬心丝虫阳性血清，使用不同批次的抗原片进行Dot-ELISA试验，每个批次做3次重复，确定其重复性。

1.2.8 特异性试验 将犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清以及犬蛔虫阳性血清按1∶50比例稀释，按照上面已建立的Dot-ELISA检测方法进行试验，观察血清交叉反应情况，确定其特异性。

1.2.9 阳性样品的检测 按照以上方法对11份犬心丝虫阳性血清进行Dot-ELISA检验，从而评价该方法检测结果与实际阳性血清的符合率。

1.2.10 初步应用 应用以上所建立的Dot-ELISA检测方法对62份犬血清样品进行检测，确定阳性样品数与阴性样品数，从而计算其阳性率。

2 结果与分析

2.1 最佳包被抗原稀释浓度的确定

当包被量小于或等于0.25 μg·片-1时，膜片中央几乎看不到斑点；当抗原包被量为1.0，0.5 μg·片-1时，膜片中央斑点显示得较为明显，且当抗原包被量为0.5 μg·片-1时，斑点大小最为均匀明显，故0.5 μg·片-1为该方法的最佳包被浓度（图1）。

2.2 最佳待检血清稀释浓度的确定

将自然感染的犬心丝虫阳性血清用洗涤液PBST按照1∶10，1∶50，1∶100， 1∶200， 1∶400的比例稀释，加入NC膜所在孔内50 μL·孔-1，分别进行Dot-ELISA检测，观察显色，稀释倍数为1：10～1：50时，膜片均呈现颜色，故可判定为阳性。所以，本试验选择1∶50作为待检血清的最佳稀释倍数（图2）。

2.3 最佳酶标二抗稀释浓度的确定

将HRP标记兔抗犬二抗用PBST按照1∶1 000， 1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000比例稀释，加入NC膜所在孔内50 μL·孔-1，分别进行Dot-ELISA检测。由图3可知，稀释倍数为1∶2 000和1∶4 000时，膜片均呈现颜色，而当稀释倍数为1∶4 000以上时，膜片颜色不明显，基本无色。所以，本试验选择1∶4 000作为酶标二抗的最佳稀释倍数。

2.4 敏感性试验

取犬心丝虫阳性血清，按照1∶50，1∶100，1∶200， 1∶400，1∶800，1∶1 600稀释，应用建立的Dot-ELISA最佳反应条件进行检测，结果显示，犬心丝虫阳性血清稀释为1∶200时，膜片呈现颜色；而当犬心丝虫阳性血清稀到1∶400时，颜色接近无色。所以，Dot-ELISA检测方法的敏感性确定为1∶200（图4）。

2.5 重复性试验

按照建立的Dot-ELISA检测方法，抗原包被浓度为0.5 μg·片-1，犬心丝虫阳性血清1∶50，HRP标记的兔抗犬二抗稀释为1∶4 000，选取3份犬心丝虫阳性血清，使用不同批次的抗原片进行Dot-ELISA试验，重复3次，观察其颜色变化。结果显示，其具有可重复性（图5）。

2.6 特异性试验

以犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清为对照，按照建立的Dot-ELISA检测方法进行检验，犬心丝虫阳性血清和犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清没有交叉反应，说明该方法特异性较强（图6）。

2.7 阳性样品的检测

通过对标准阳性样品的检测，结果表明，本试验建立的Dot-ELISA检测方法对辽宁省丹东市11份已知的犬心丝虫阳性血清检测均表现为阳性，即检测结果与实际阳性样品的符合率为100%。

2.8 Dot-ELISA检测方法的初步应用

应用已建立的Dot-ELISA方法对吉林省某地62份待检血清进行检测，结果检出3份阳性样本，阳性率为4.8%。

3 结论与讨论

犬心丝虫是一种能够引起犬等心脏机械性栓塞并致死的人畜共患寄生虫[1，12]。其检测方法有多种，但传统方法过于繁琐，不适于大量检测；分子生物学检测技术又过于依赖试验仪器[12-14]。而Dot-ELISA方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点，并且不需要仪器就可以通过肉眼直接观察结果，大大地方便了操作者对阳性样品的判断，易在基层检疫工作中推广[15]。

本研究所用的包被抗原为吉林大学动物寄生虫学实验室先前筛选获得的马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白同源蛋白MTFP，经ELISA及Western blot鉴定发现MTFP基因蛋白具有良好的反应原性。侯洪烈等[16]利用MTFP蛋白建立了犬心丝虫间接ELISA检测方法，结果发现，其具有敏感性高、特异性强等特点，并认为其可作为候选诊断抗原建立检测方法。本研究在吉林大学动物寄生虫学实验室建立的间接ELISA检测方法基础上，通过8 mol·L-1尿素的方法纯化MTFP蛋白，通过梯度透析法将MTFP蛋白在体外进行重折叠，得到了较高浓度的可溶性蛋白，用于本试验的包被抗原，结果发现，其具有较好的反应原性。其结果为犬心丝虫病的诊断提供了一种新的方法。

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