NINJ2基因多态性与陕西地区脑梗塞患者的相关性的研究

孔祥丽，张 雷，李军朝，李亚军

（西安医学院第一附属医院神经内科，西安 710077）

NINJ2基因多态性与陕西地区脑梗塞患者的相关性的研究

孔祥丽，张 雷，李军朝，李亚军

（西安医学院第一附属医院神经内科，西安 710077）

目的：探讨神经损伤诱导蛋白2（NINJ2）基因多态性与陕西地区缺血性脑卒中的关系。方法：选取2014年1月～2016年2月在我院治疗的缺血性脑卒中患者172例作为观察组，同时选取在我院进行体检的110例健康人作为对照组，采用聚合酶联反应-限制性片段长度多态性技术对NINJ2 rs10849373、rs4980840、rs2535393和rs11063806位点进行基因型检测，比较观察组和对照组基因型和等位基因频率的差异。结果：观察组体重指数（BMI）、血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）分别为（25.22±1.89）kg/m2、（4.81±1.22）mmol/L和（3.01± 0.82）mmol/L，吸烟和饮酒的比例分别为40.70%和27.91%，均高于对照组，差异比较有统计学意义；rs10849373、rs4980840、rs2535393和rs11063806位点GG、GA和AA基因型在观察组和对照组的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；观察组rs10849373位点AA、GA基因型以及等位基因A的频率分别为11.63%、40.12%和31.69%，明显高于对照组，rs10849373位点的基因型及基因频率在观察组和对照组间差异有统计学意义；rs4980840、rs2535393和rs11063806位点在观察组和对照组间的分布差异无统计学意义。结论：NINJ2基因中rs10849373位点与陕西地区缺血性脑卒中有关，需进一步研究。

NINJ2基因；单核苷酸多态性；缺血性脑卒中；陕西

脑卒中是一组以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，临床上缺血性脑卒中发病率较高，近年来由于高血压、糖尿病以及动脉粥样硬化等基础疾病的的发生发展，脑卒中的诊治面临的严峻的威胁。部分学者通过大量多中心的回顾性分析研究证实，高血压、血糖代谢异常、高血脂等基础疾病导致的脑血管内皮细胞功能障碍，为缺血性脑卒中发病独立危险因素［1，2］，然而迄今为止对于脑卒中的发病机制的研究仍然不足，其病因仍然不清除。

近年来相关基础研究表明在脑卒中的发生发展过程中，部分基因转录水平及翻译水平的改变能够显著影响到脑血管事件的结局，特别是对于具有高血压、糖尿病以及高脂血症等高危因素的患者，基因多态性对于脑血管疾病的发生发展的影响更为显著［3，4］。神经损伤诱导蛋白（Nerve injury induced protein 2 gene，NINJ2）近年来在脑卒中患者的局部脑组织的缺血缺氧性耐受以及缺血再灌注损伤中均发挥了重要的作用，而NJNJ2的相邻基因位点rs10849373与东南沿海地区的脑卒中患者的发病相关，可以作为独立预测患者发生脑卒中的独立风险因素［5，6］，但rs10849373与陕西地区脑卒中患者的相关关系研究不足，本次研究重在探讨本地区NJNJ2的基因多态性与脑卒中发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月～2016年2月在我院治疗的缺血性脑卒中患者172例作为观察组，同时选取在我院进行体检的110例健康人作为对照组，两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。纳入标准：（1）观察组患者符合WHO关于缺血性脑卒中的诊断标准，对照组无脑卒中等疾病；（2）均为陕西地区常住人口；（3）入选前1个月未使用过抗凝或抗血小板药物；（4）近3个月未发生心肌梗死疾病；（5）患者及家属知情同意并签署同意书；（6）依从性高，可积极配合研究。排除标准：（1）合并严重心、肝、肾等重要器官严重病变、恶性肿瘤、风湿性疾病、代谢障碍、脑外伤等疾病；（2）心源性栓塞及其他型脑卒中；（3）妊娠期或哺乳期妇女；（4）对本次研究采用的检测方法有较好的耐受性。

表1 两组一般资料比较（n）

1.2 实验方法 体重指数的计算：体重指数（BMI）=体重（kg）÷身高2（m）。

TC和LDL的检测：采取患者和健康者静脉血，经1500rpm离心5min后得到血清，4℃保存待测，一次性真空采血管（血液凝固实验专用）内有3.1%柠檬酸钠，日本株氏会社生产，严格按标准采集标本，TC、LDL的检测采用Sysmex系列CA-1500全自动生化分析仪器检测，试剂由 DadeBehring公司配套生产。

NJNJ2的基因多态性检测：取冻存的血清保存液体，按照10000r/min的离心速度进行离心分离，每1mL的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2mL的氯仿，进行裂解操作，4摄氏度冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10000r/min离心5min，得到RNA。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μL，37℃水浴60分钟，室温放置5分钟使其完全溶解，使其逆转录为cDNA。以β-actin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得总体积达20 μL，上机，反应条件为：93℃2min、93℃ 1min、55℃ 2min，共40个循环。

PCR产物扩增后进行基因多态性检测：参考multiplexkit试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）使用说明，加入各位点对应延伸引物进行单碱基测序反应。并在ABI1310（Life Technologies，美国）进行电泳，结果用GENEMAPPER软件（Life Technologies，美国）进行分析。rs10849373上游引物：5-3 GGATTGTGGCCTTCTTTGAG，下游引物：5-3 CCAAACTGAGCAGAGTCTTC。rs4980840、rs2535393和rs11063806基因多态性的检测参考rs10849373的检测。

1.3 统计学处理 数据处理分析采用SPSS19.软件，组间比较使用t检验。采用拟合优度c2检验分析各基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。计数资料比较采用c2检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般特征比较 观察组BMI、TC和LDL分别为（25.22±1.89）kg/m2、（4.81±1.22）mmol/L和（3.01 ±0.82）mmol/L，吸烟和饮酒的比例分别为40.70%和27.91%，均高于对照组，差异比较有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组一般特征比较（n）

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 通过拟合优度c2检验，各SNP位点三种基因型在观察组和对照组的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，见表3。说明所选样本可代表大人群的遗传特征。

表3 Hardy-Weinberg平衡检验［n（%）］

2.3 基因型和等位基因频率比较 rs10849373位点的基因型及基因频率在观察组和对照组间差异有统计学意义（P＜0.05），观察组rs10849373位点AA、GA基因型以及等位基因A的频率分别为11.63%、40.12%和31.69%，明显高于对照组。rs4980840、rs2535393和rs11063806位点在观察组和对照组间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

SNP 基因型 χ2P 等位基因 χ2 P GG GA AA G A rs10849373观察组 83（48.26） 69（40.12） 20（11.63） 10.91 0.004 235（68.31） 109（31.69） 11.705 0.001对照组 73（66.36） 33（30.00） 4（3.64） 179（81.36） 41（18.64）rs4980840观察组 81（47.09） 71（41.28） 20（11.63） 0.014 0.993 233（67.73） 111（32.27） 0.013 0.909对照组 51（46.36） 46（41.82） 13（11.82） 148（67.27） 72（32.73）rs2535393观察组 46（26.74） 87（50.58） 39（22.67） 0.134 0.935 179（52.03） 165（47.97） 0.068 0.794对照组 29（26.36） 54（49.09） 27（24.55） 112（50.91） 108（49.09）rs11063806观察组 105（61.05） 57（33.14） 10（5.81） 0.163 0.922 267（77.62） 77（22.38） 0.049 0.825对照组 65（59.09） 39（35.45） 6（5.45） 169（76.82） 51（23.18）

3 讨论

颈内动脉和椎动脉闭塞、狭窄可引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，男性较女性多，严重者可引起死亡，其中出血性卒中的死亡率较高。一项汇集了近五年来189例脑卒中患者的相关临床研究显示，脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因，脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床上预后较差［7，8］，且患者出院后3个月内的再次复发率可达15.5%［9］。不良的生活习惯如吸烟、不健康的饮食、肥胖、缺乏适量运动、过量饮酒和高同型半胱氨酸，同时脑部血管的血栓形成以及栓塞的脱落等，均可进一步促进脑卒中的发生发展。虽然对于脑卒中的病因研究仍然处于基础阶段，但近年来随着单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的研究的进展，SNP基因水平的突变以及群体性改变在恶性肿瘤、先天性疾病以及自身免疫性疾病或者脑血管疾病中均具有重要的作用，特别是SNP与缺血性脑卒中的发生关系更为密切［10，11］。NINJ2 基因编码的蛋白为膜蛋白，NJNJ2在脑血管的内皮细胞的损伤、内皮下脂质的沉积以及神经损伤后的修复过程中均发挥了重要的调节作用，NJNJ2的异常上调可以促进蛛网膜下腔出血的几率，并增加出血性脑卒中的发生率［12，13］。虽然在探讨NJNJ2的SNP的过程中发现，rs4980840、rs2535393等SNP在东南沿海、东北地区以及广东闽南地区的汉族人群中与脑卒中的发生具有显著的关联，并发现rs4980840、rs2535393中的基因A/G可以作为评估缺血性脑卒中发生的独立危险因素［14］，但对于陕西本地区的研究不足，本次研究的创新性在于首次探讨了rs10849373、rs4980840、rs2535393和rs11063806等SNP与本地区脑卒中患者发生发展的关系，并进一步进行了相关基因型和基因频率的差异。

BMI、TC和LDL是脑卒中发生的独立危险因素，本次研究中观察组脑卒中患者的BMI、TC和LDL均明显上升，其中BMI可达25.22±1.89，而LDL可达3.01± 0.82pg/ml，LDL的上升可以促进脑卒中的发生，特别是当LDL上升0.5pg/ml时，脑卒中的发生率可上升5%以上，另外观察组患者的吸烟以及饮酒的患者比例也明显高于对照组，表明临床上对于具有相关高危因素的患者应加强随访，增加早期脑卒中的诊断水平。哈迪-温伯格定律（Hardy-Weinberg）的主要内容是指在理想状态下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在遗传中是稳定不变的，即保持着基因平衡，但种群足够大、种群个体间的交配是随机的、没有基因突变以及新的基因的掺入，本次研究中rs4980840、rs2535393、rs11063806以及rs10849373的AA、AG、GG等基因型间均无统计学差异，提示存在明显的Hardy-Weinberg平衡，说明本研究对象对两位点基本为一连锁平衡群体，对照组具有群体代表性。虽然Wu D F等［15］学者分析了76例脑卒中患者的SNP资料后发现，rs4980840与广东地区汉族人群的脑卒中的发生具有密切的关系，但本次研究中rs4980840、rs2535393和rs11063806与陕西地区的脑卒中患者的发生发展无明显关联，考虑可能试验方法的设计方法不一致、种族和地域的差异，另外SNP导致的基因连锁不平衡性可能进一步掩盖了rs4980840、rs2535393和rs11063806等作为脑卒中预测风险因素的价值。然而，笔者注意到rs10849373位点AA、GA基因型以及等位基因A的频率分别为11.63%、40.12%和31.69%，明显高于对照组，表明rs10849373等位基因型以及等位基因频率改变是脑卒中发生的风险因素，AA、GA基因型的遗传变异可以促进脑卒中的发生和病情的进展。

综上所述，根据本研究结果，NINJ2基因中rs10849373位点与陕西地区缺血性脑卒中有关，而rs4980840、rs2535393和rs11063806基因多态性与本地区脑卒中的发生发展无明显关联，但相关研究结论仍然需要分析流行病学进一步探讨。

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Association study of NINJ2 gene polymorphism and cerebral infarction patients in Shaanxi area

Kong Xiang-li, Zhang Lei, Li Jun-zhao, Li Ya-jun
(The First Affilitated Hospital of Xi'an Medical College, Xi'an 710077, China)

Objective To investigate the relationship between the Nerve injury induced protein 2 gene(NINJ2)polymorphism and ischemic stroke in Shaanxi area. Methods From January 2014 to February 2016, 172 cases of ischemic stroke patients in our hospital were selected as observation group, at the same time, 110 healthy persons were selected as the control group, used polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism to dected NINJ2 gene rs10849373, rs4980840, rs2535393 and rs11063806 locus genotype, compared the differences of genotype and allele frequencies between the observation group and the control group. Results Observation group body mass index(BMI), serum total cholesterol(TC)and low density lipoprotein(LD L)were(25.22±1.89)kg/m2, (4.81±1.22)mmol/L and(3.0±0.82)mmol/L, the proportion of smoking and drinking were 40.70% and 27.91%, were higher than the control group, the difference had statistical significance; rs10849373, rs4980840, rs2535393 and rs11063806 locus GG, AA and AA genotype frequency distribution accords with the Hardy- Weinberg equilibrium in the observation group and control group; Observation group rs10849373 locus AA and GA genotype and allele A frequency were 11.63%, 40.12% and 31.69%, significantly higher than the control group, rs10849373 locus genotype and gene frequency differences between the observation group and the control group had statistical significance; rs4980840, rs2535393 and rs11063806 locus distribution difference between the observation group and the control group was not statistically significant . Conclusion NINJ2 gene rs10849373 locus is associated with ischemic stroke in Shaanxi area, which needs further study.

NINJ2 gene; single nucleotide polymorphism; ischemic stroke; shaanxi

R743.3

A

1673-016X（2016）05-0010-04

2016-05-04

基质金属蛋白酶基因9多态性与脑梗死相关性的研究（No. XYFY10-14）；陕西省卫生厅科研基金中标项目（No. 2010H27）

孔祥丽，E-mail：kongxiangli_1980@163.com