H2O2对流行性乙型脑炎的灭活效果研究

蔡雨函, 叶健强, 周远成,3, 王 翱, 李 碧

(1. 畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610299；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都61066；3.四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都610299)

H2O2对流行性乙型脑炎的灭活效果研究

蔡雨函1,3, 叶健强1,2, 周远成1,2,3, 王 翱1,3, 李 碧1,3

(1. 畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610299；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都61066；3.四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都610299)

流行性乙型脑炎是由日本脑炎病毒引起的，在自然界中主要以猪为宿主，经蚊为主的虫媒传播的一种人兽共患的嗜神经性急性传染病。疫苗免疫是防控易感猪群乙型脑炎的主要措施，但国内尚无商品化猪流行性乙型脑炎灭活疫苗。灭活剂是影响灭活疫苗效果一个重要因素，研究通过先观察过氧化氢酶催化分解H2O2的效果，然后利用TCID50方法结合PT-PCR方法检测H2O2对JEV灭活效果。结果显示当过氧化氢酶终浓度达到400 U/mL时，能够将3% H2O2分解完全；3% H2O2灭活JEV 4 h能够灭活完全，为以后评价JEV灭活苗的免疫效果提供数据支撑。

H2O2；流行性乙型脑炎；灭活

流行性乙型脑炎（Japanese encepha1itis， JE）又称日本脑炎，简称乙脑，是由黄病毒科（F1aviviridae）黄病毒属的重要成员日本脑炎病毒（Japanese encepha1itis virus， JEV）引起的一种人兽共患的虫媒介导的嗜神经性急性传染病。该病毒一般是通过猪一蚊一人的方式引起感染，人是JEV传播途径的终末宿主，由于猪感染后病毒血症持续时间长，病毒效价较高，因此猪被认为是JEV最重要的扩增宿主和人类乙脑的主要传染源之一［1］。该病毒感染猪后造成种猪繁殖障碍，严重制约养猪业的发展，同时也造成巨大的经济损失。目前疫苗接种仍是控制乙脑流行最有效的方法，但国内尚无商品化猪流行性乙型脑炎灭活疫苗。

灭活剂是影响灭活疫苗效果的一个重要因素。甲醛是制备灭活疫苗最常用的灭活剂之一，但用于病毒灭活时会破坏关键的抗原表位导致免疫原性降低，甚至在某些情况下导致严重的疾病［2］。β-丙内酯是目前仅次于甲醛广泛应用于疫苗研制的另一种灭活剂，但有研究发现，β-丙内酯灭活病毒制备的疫苗可能会导致免疫副反应，包括化学修饰疫苗抗原诱导过敏反应［3］。因此，研究新型、安全的病毒灭活剂对于研制高效的猪流行性乙型脑炎灭活疫苗具有重要价值。H2O2（过氧化氢，俗称双氧水）是一种高效的氧化剂，能快速地灭活RNA和DNA病毒，对抗原结构及免疫原性产生轻微的损伤，是目前最有潜力的病毒灭活剂。本研究探讨H2O2灭活JEV的效果，为以后研究H2O2灭活JEV的免疫效果提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞

JEV SC株由四川华神兽用生物制品有限公司重点实验室分离并保存；BHK-21细胞由四川华神兽用生物制品有限公司重点实验室保存。

1.2 主要试剂

DMEM、胎牛血清均购自GIPCO公司；96孔板购自Costar公 司；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000购自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa RNAiso P1us、PrimeScript RT Kit购自大连宝生物工程有限公司；H2O2为国产分析纯。

1.3 过氧化氢酶催化分解H2O2试验

1.3.1 样品制备将30% H2O2原液用含2% FBS DMEM培养液稀释后，使H2O2终浓度为3%；然后加入不同体积H2O2酶，使其终浓度分别为50、100、200、300、400、500 U/mL，并设置未加入H2O2酶作为阴性对照，在室温条件下放置20 min。

1.3.2 BHK-21细胞的制备取传代后48 h的BHK-21细胞，观察细胞汇合度达到90%以上，去除细胞培养液，用胰酶常规消化后，将细胞悬液加入到96孔板中，每孔加入100 μL，共7个96孔板，37 ℃，5% CO2培养24 h，使其细胞刚好铺满96孔板。

1.3.3 分解效果观察

将处理好的含不同浓度H2O2酶的3% H2O2进行10倍倍比稀释。具体方法如下：取1.5 mL离心管10个，分别编号1-10，在每个离心管中加入900 μL含2%FBS的DMEM。取样品100 μL，加入到第一个离心管中，混匀后取100 μL到另外一个离心管中，以此方法稀释至第10孔。将稀释好的样品（稀释梯度从100～10-8）加入到96孔板中，每个梯度重复8孔（一列），每孔100 μL，并于第11列中加入100 μL含2%FBS的DMEM作为空白对照；然后置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养3 d，并每天观察记录细胞生长状态。

1.4 H2O2对JEV灭活效果的检测

1.4.1 样品制备

H2O2灭活JEV的方法为：将JEV SC株病毒液用30% H2O2原液稀释后，使H2O2终浓度达到3%，置于4 ℃环境中，分别在灭活0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h后取出并加入1.3确定的H2O2酶浓度，然后在室温条件下放置20 min。同时设立甲醛灭活JEV的阳性对照组及H2O2灭活JEV后未加入H2O2酶的阴性对照组。

甲醛灭活JEV的方法为：在JEV SC株病毒液中甲醛的体积分数为0.35%，在室温条件下作用24 h，随后在灭活病毒液中加入0.02%硫代硫酸钠终止灭活，加入的量为每毫升加5 μL终止剂。

1.4.2 BHK-21细胞的制备

按照1.3.2方法制备BHK-21细胞，共12个96孔板，37 ℃，5% CO2培养24 h。

1.4.3 TCID50的测定

将处理好的H2O2灭活不同时间的JEV病毒液按照1.3.3方法进行10倍倍比稀释。将稀释好的样品（稀释梯度从100～10-8）加入到96孔板中，每个梯度重复8孔（一列），每孔100 μL，并于第11列中加入100 μL含2%FBS的DMEM作为空白对照；然后置37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养3 d，观察记录细胞生长状态，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50并绘制灭活曲线。

1.4.4 RT-PCR检测

观察96孔板中细胞生长状态，取H2O2完全灭活JEV时间段的样品（即稀释梯度为100），共8个孔，每2个孔（即共200 μL）收集在一个EP管中，分别编号为1-4，采用常规方法抽取RNA及按照试剂盒说明书反转录合成cDNA。采用20 μL体系进行PCR 反应，其中上下游引物（10 μmo1/L）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL，反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸35 s，30个循环，最后72 ℃再延伸5 min。PCR 产物用 10 g/L琼脂糖凝胶进行鉴定。引物序列如下：JEV-P1：5`-AAGTGTTTGGTGGTGCCTTC-3`，JEV-P2：5`-CCAAAGCAATTGATCGGTCT-3`，目的片段大小为120 bp。

2 实验结果

2.1 H2O2酶催化分解H2O2试验

通过观察BHK-21细胞形态发现（见表1），当H2O2酶终浓度达到400 U/mL时，在室温放置20 min内，H2O2酶能够将H2O2分解完全。

表1 过氧化氢酶催化分解H2O2结果

2.2 病毒灭活曲线的绘制

根据TCID50方法绘制H2O2灭活JEV SC株的灭活曲线（见图1），结果显示3% H2O2灭活JEV 4 h灭活完全。

图1 病毒灭活曲线

2.3 RT-PCR检测结果

取在96孔板中培养3 d后用3% H2O2灭活JEV 4 h的病毒液（稀释梯度为100）进行PT-PCR检测，结果显示（见图2），编号1-4均未检测出JEV阳性，而阳性对照出现目的条带，表明3% H2O2灭活JEV 4 h能够灭活完全。

图2 RT-PCR检测结果

3 讨论

由于H2O2最终分解产生氧气和水，不需要复杂的纯化工艺即可将其从制备过程中去除，因此其获美国FDA认证为一种环保化工试剂。而且许多研究证实H2O2灭活苗能够产生高效的免疫保护，已用于灭活RNA和DNA病毒，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（1ymphocytic choriomeningitis virus， LCMV)，黄热病病毒(ye11ow fever virus， YFV)，西尼罗病毒(West Ni1e virus ， WNV)，牛痘病毒(Vaccinia virus， VV)，猴 痘 病 毒 (monkeypox virus， MPV) 及 狂 犬 病 病 毒(rabies virus)［4-7］。这表明H2O2作为一种新型病毒灭活剂，具有很广阔的应用前景。

特别指出的是，JEV与WNV具有高度的基因和蛋白同源性，H2O2灭活的WNV接种小鼠后能够产生高滴度病毒特异的中和抗体，并完全保护小鼠抵抗致死性攻毒，因此应探讨H2O2灭活JEV的效果，以及H2O2灭活JEV抗原在小鼠及猪体内的免疫效果，为新型猪流行性乙型脑炎灭活疫苗的研制提供参考数据。本研究利用TCID50方法结合PT-PCR方法检测H2O2对JEV灭活效果，为以后评价JEV灭活苗的免疫效果奠定基础。

过氧化氢酶能够催化H2O2分解，为了保证在H2O2灭活病毒后H2O2能够分解完全，不影响实验结果的判定，本研究在H2O2灭活JEV后加入过氧化氢酶，以催化H2O2分解。在过氧化氢酶催化分解H2O2的试验中，结果显示，当过氧化氢酶终浓度达到400 U/mL时，接种细胞后细胞形态才能保持正常。

JEV灭活效果显示，3% H2O2灭活JEV 4h灭活完全，接种细胞后细胞形态保持正常，以前有研究显示1% H2O2灭活JEV 20 h才能灭活完全［8］，因此对比来看，在以后制备乙脑灭活疫苗过程中，选用3% H2O2灭活JEV，能够大大节约时间成本。本研究还显示2%甲醛37 ℃灭活病毒36 h灭活完全，甲醛灭活苗作用细胞后，细胞出现脱落，状态变差，继续传代没有检测到JEV，可能是残留的甲酸对细胞有毒性。这也表明H2O2相较于甲醛作为灭活剂的优势，灭活产物没有残留，以此制备的灭活苗更安全稳定。

［1］ 蔡宝祥.我国流行性乙型脑炎研究近况［J］.畜牧与兽医，2012，44(7)： 1-5.

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［7］ ABD ELGHAFFAR A A， ALI A E， BOSEILA A A， et a1. Inactivation of rabies virus by hydrogen peroxide［J］. Vaccine， 2016， 34(6)： 798-802.

［8］ 李朋. 日本脑炎病毒样颗粒疫苗及双氧水灭活疫苗的探讨性研究［D］.南京：南京农业大学， 2013.

2016-09-08)

四川省公益性科研院所基本科研项目（SASA2014A15）；四川省科技支撑计划（2015NZ0105）

蔡雨函（1990-），女，四川南充人。

周远成，博士，主要从事动物传染病病原分子生物学研究