急性心肌梗死患者内脏素mRNA基因表达及临床相关性的研究

何皓+黄海峰+符福强+李筱敏+徐晓云

【摘要】 目的：探讨急性心肌梗死患者内脏素基因在脂肪组织中表达情况，以及内脏素mRNA基因表达与患者临床相关性研究，为急性心肌梗死患者防治提供新的方法。方法：根据临床诊断标准将80例急性心肌梗死患者作为急性心肌梗死组，将100例正常人作为对照组。用RT-PCR方法检测内脏素mRNA的水平和基因的表达水平，并同时收集比较两组的临床检查数据指标。结果：急性心肌梗死患者组的血清内脏素浓度及脂肪组织中的内脏素mRNA基因表达均高于对照组（P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪组织的mRNA的表达量与WHR、胆固醇、甘油三酯均呈正相关性（P<0.05）。急性心肌梗死患者内脏素的量与机体临床的甘油三酯、胆固醇、LDL-C均呈正相关性（P<0.05）。结论：急性心肌梗死患者中内脏素基因与浓度表达增高，可能是急性心肌梗死的一个独立危险因素。

【关键词】 急性心肌梗死； 内脏素； mRNA基因表达； 脂肪组织

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mRNA gene in the adipose tissue of patients with acute myocardial infarction，and to provide a new method for the prevention and treatment of patients with acute myocardial infarction.Method：According to the criteria of clinical diagnosis，80 patients with acute myocardial infarction were enrolled as acute myocardial infarction group， and 100 normal people were served as control group.RT-PCR method was used to detect the level of mRNA and the expression level of gene，and the clinical data of the two groups were collected and compared.Result：The plasma visfatin level and the quantitaitive of visfatin mRNA expression adipose tissues of acute myocardial infarction of patients were significantly higher than those in control group（P<0.05）.The expression of mRNA in adipose tissue of patients with acute myocardial infarction was positively correlated with WHR，TG，TC（P<0.05）. The amount of internal organs in patients with acute myocardial infarction was positively correlated with the clinical TG，TC，and LDL-C（P<0.05）.Conclusion：In patients with acute myocardial infarction， the increased expression of the internal organs and the concentration of the internal organs may be an independent risk factor for acute myocardial infarction.

【Key words】 Acute myocardial infarction； Visfatin； mRNA expression； Adipose tissues

First-authors address：Nanhai Hospital of the Southern Medical University，Foshan 528200，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.003

急性心肌梗死属于急性冠脉综合征一种类型，急性心肌梗死有急性ST段抬高性心肌梗死和急性非ST段抬高性心肌梗死，临床上发病急、死亡率高，而心肌梗死发病证明与许多的机体内细胞因子有关，内脏素就是其中的一种，日本学者Fukuhara在2005年研究中发现了它，许多的研究证明内脏素来源机体内各种脂肪组织，不同的是有的人认为来源腹部脂肪，有的人认为来源内脏脂肪。欧美的科学家研究证明内脏素作为一种脂肪分泌细胞因子，是一种能够降低机体中血管血液血糖值的拟胰岛素活性的物质，同时也能促进机体体内的各种脂肪组织的合成与聚集，尤其与腹部脂肪的分布关系密切，后来的研究同时也证明内脏素合成与分泌同机体体内的血管内皮细胞的炎症反应有关，所以认为其可能参与心肌梗死患者的心脏冠状动脉的炎症反应，推断可能和急性心肌梗死患者发生和发展有关[1]。目前该方向的研究在国内国外不多，且争议太多，但是内脏素是如何造成急性梗死患者的冠脉血管炎症反应，仍需要更多的研究和实验去证明。本研究通过测定急性心肌梗死患者内脏素的血清水平及基因表达，来分析急性心肌梗死患者发生与发展是否与患者的脂肪组织分泌的内脏素存在某种必然的联系[2]。笔者大胆假设：内脏素可以造成急性心肌梗死发生，针对内脏素的控制则有可能成为急性心肌梗死患者的预防及治疗的新靶点，从而减少一部分急性梗死患者发生。现阶段，国内外研究这方面的不多，尤其在急性心肌梗死方面研究是空白。所以本课题组第一次在进行内脏素基因在中国汉族人群分布研究，分析急性心肌梗死患者内脏素在机体的表达研究，以及与临床检查结果等相关性研究，来为急性心肌梗死患者提供一种可能的新的预防及治疗方法，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年4月在南方医科大学南海医院腹外科100例胆石症患者作为对照组，排除一切临床心脑血管病患者；另选取2013年12月-2015年4月在广东省人民医院及南方医科大学南海医院急性心肌梗死患者80例作为急性心肌梗死组，患者均经心肌酶三项、肌钙蛋白、心电图、动态心电图及冠状动脉造影的结果确诊。排除恶性肿瘤、血液病、各种急慢性炎症期、各种急慢性心、脑血管病及其他相关的内分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本留取 急性心肌梗死的患者急诊抽取静脉血5 mL，胆石症患者在术晨抽取空腹静脉血5 mL，在医院实验室高速离心机中分离研究对象的血清，分离出来的血清标本立即送检验科予FINS、血糖、FBG、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸等基本临床指标测定，另一管保存在南方医科大学南海医院-80 ℃专用试验冰箱内，并分批次送广东省人民医院分子生物试验室测内脏素mRNA的水平。急性心肌梗死患者在股动脉穿刺时取腹部脂肪或冠脉搭桥时取脂肪组织液氮迅速冻存，对照组胆石症患者手术时取皮下脂肪或大网膜脂肪液氮迅速冻存，用于研究内脏素RNA提取。

1.2.2 RNA提取 用通用的TRIZOL法提取，在实验室用紫外发光光度计测定内脏素RNA浓度和含量。

1.2.3 内脏素基因的mRNA表达水平检测步骤 （1）研究对象内脏素基因引物的设计与合成：研究采用半定量RT-PCR方法扩增目的基因，实验对照内参照肌动蛋白基因（β-actin）。然后在PUBMED上以Genebank基因库上发布的人内脏素基因与β-actin基因的作为序列，利用国际通用的引物软件（Primer-5）设计引物。笔者得出的β-actin的两条基因扩增引物基因序列分别为5-CAGCACTGTGTT GGCGTACA-3及5-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3，扩增后基因产物的长度为495 bp。而另一个Visfatin基因的扩增引物为5-TTACATACA CACAAC ACACACCC-3，5-GCCGATTATCTTTACATAGGACG-3，基因扩增后产物为片断228 bp基因片段。（2）第二阶段，研究对象目的基因cDNA的合成：采用PROMEGA公司生产的逆转录试剂盒将特定目的的RNA逆转录合成，形成研究对象目的基因的cDNA。（3）第三阶段，采用聚合酶链反应（PCR）合成所需要的研究需要的第二条链，聚合酶链的反应体系物质如下：dNTP 2 μL（2.5 mmol/L）及β-actin基因上、下游引物各1.0 μL、Visfatin基因上下游引物各1.0 μL、

10×缓冲液Buffer（含氯化镁）5 μL、Taq酶

0.5 μL（2.5 U）、目的cDNA 2 μL、ddH2O 36.5 μL。研究的PCR的热循环条件及参数：首先预变性1 min（在94 ℃高温），反应物质变性30 s（在94 ℃高温），变性后产物退火30 s（54 ℃），在72 ℃温度时产物再延伸1 min，反复重复上述的循环，30次后，最后一次循环后在72 ℃彻底延伸时间为4 min，最后完成产物的PCR。（4）笔者把所得PCR的产物，放在自制的2%琼脂的糖凝胶电泳平板上进行PCR产物的电泳，电泳后结果最后放在美国gene电泳凝胶成像机器上观察，并用数码照相机把观察的结果的图像进行摄像，并保存原始数据，笔者采用标准β-actinDNA条带灰度及内脏素DNA条带灰度对比计算[6]。（5）所有试验对象的血清内脏素的测定采用美国专用内脏素专用试剂盒，在实验室专人化学发光法测定。FINS、血糖、FBG、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸等各种临床数据生化指标测定采用放免法测定得出。（6）血清内脏素的测定，采用美国试剂盒，化学发光法测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，临床相关性的数据与急性心肌梗死的相关系分析采用多元回归相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的临床及实验室数据比较 急性心肌梗死患者组的机体内的内脏素浓度、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、体重指数、血清甘油三酯、血清胆固醇、LDL-C、FFA（游离脂肪酸）均高于正常手术的对照组（P<0.05）；而急性心肌梗死与正常手术对照组的年龄、性别、血压、高密度脂蛋白、FINS比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 两组内脏素脂肪组织中的分泌的内脏素RT-PCR的量比较 急性心肌梗死患者脂肪组织的RT-PCR的内脏素mRNA的表达量为0.713±0.041，明显高于对照组内脏素mRNA的表达量为0.532±0.036，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 急性心肌梗死患者脂肪组织的mRNA的表达量及内脏素的浓度多元回归相关性分析 急性心肌梗死患者内脏素的量与机体临床的甘油三酯、胆固醇、LDL-C等血脂指标均呈正相关性（OR=1.53、1.43、1.36，P<0.05），而与一般的临床年龄、性别、血压、FINS、HDL-C、HOMA-IR无相关性（OR=0.9，P>0.05）。急性心肌梗死患者脂肪组织的mRNA的表达量与WHR、胆固醇、甘油三酯呈正相关性（OR=1.57、1.33、1.52，P<0.05）。急性心肌梗死患者脂肪组织的mRNA的表达量与HDL-C、LDL-C无明显的相关性（OR=0.9，P>0.05）。

3 讨论

改革开放以来，急性心肌梗死已成为影响人类生活质量的一类常见病、多发病，同时，伴随着相关的疾病如肥胖和糖尿病代谢类疾病的增加，心血管的危重症发病也大大的升高。研究证明许多的细胞因子参与心肌梗死的形成，内脏素就是其中一种。内脏素由日本的学者发现的，主要是由人体体内及动物脂肪组织所分泌出来的具有许多生物活性的脂肪细胞因子，以前的许多研究证明其的分泌与生物活性与机体内血管内皮细胞炎症反应有着密切的关系[1-4]。众所周知，急性心肌梗死在许多的研究中也证明其与心脏冠状动脉血管内皮细胞炎症反应及不稳定斑块的形成有关，因此笔者推断其内脏素的分泌及水平可能和急性心肌梗死患者的发病有关[5-7]。目前在国内外研究中关于这方面的论述不多，内脏素虽然具有多种机体上的生物学效应，但是其在一系列代谢疾病中病理作用的生理机制研究不是十分清楚，这方面的研究也不多。本研究拟通过分析急性心肌梗死患者的内脏素基因表达水平，来分析其与临床各项指标的关系及可能存在的机制，揭示急性心肌梗死患者发生与发展是否与机体内内脏素的基因及分泌水平存在一定的关系。

日本的Fukuhara等科学家在实验的同时也发现机体血清内脏素的量越高，机体的内脏脂肪细胞就越丰富，但是却与机体皮下脂肪组织变化不大，而相反的是科学家Arike的研究却证明越是肥胖的人，机体内脏脂肪内内脏素的表达量相应的增多，证明它与肥胖是一定的相关性的[8-9]，而相矛盾的是科学家Hammarstedt等[10]却在最近的研究没有发现内脏素在体内脂肪组织中表达增多的现象，没有发现它们之间有什么关系，为什么会有如此相互矛盾的地方，本文的研究结果是在急性心肌梗死组中脂肪组织的mRNA的表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），急性心肌梗死患者内脏素的浓度与年龄、性别、血压、FINS、HDL-C、HOMA-IR无关，与临床上血脂数据如胆固醇、甘油三酯、LDL-C呈正相关性。同时急性心肌梗死患者检测出来的内脏素mRNA的RT-PCR数值与WHR、胆固醇、甘油三酯呈正相关性，而临床血脂的另两个指标HDL-C、LDL-C与急性梗死组大网膜脂肪组织的mRNA的表达量却没有明显的相关性。所以笔者发现试验中急性心肌梗死患者血清中内脏素的浓度高于正常对照组，以及发现急性心肌梗死患者内脏素mRNA的RT-PCR数值也同样升高，本文的研究结果与2014年河北医学发表冠心病的内脏素的研究有相似结论，但是测重点又不相同。不同的是他们研究对象是一般的冠心病，相对病情轻[11]，而本文研究的是急性ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者，一般都有心肌酶学的升高，但是由于他们选择的冠心病标本比较容易收集，收集数据大大多于本文，所以和本文的试验还是有很大的不同。为什么会出现这样的结果，笔者分析分泌出来的内脏素可能在血管内发挥其生物活性，它不仅能像胰岛素一样通过发挥作用来降低机体血糖，还可以在机体内促进不同部位器官血管脂肪的合成与聚集，在血管壁促进吞噬细胞形成泡沫细胞，泡沫细胞和血小板及一些炎症细胞构成血管壁粥样硬化及脂质斑块的形成，一些不稳定的斑块在特殊情况下容易脱落下来形成急性心肌梗死，造成血管的阻塞。同时内脏素能直接作用机体组织血管的血管内皮细胞，通过分子通路引起血管内的内皮细胞各种功能代谢出现障碍，血管内皮细胞的不断损伤而出现血管的狭窄，上述的种种细胞及组织的破坏及修复最终成为急性心肌梗死患者的发生和发展的启动因素及决定的因素[12-13]。

综上所述，本文研究证明，内脏素在急性心肌梗死患者起病中及疾病的发展中有着十分重要的角色。这也许为日后急性心肌梗死患者的预防和治疗有一个新的方法，一个新的突破点。同样如何利用急性心肌梗死患者的内脏素基因来控制机体内脏素的分泌，以及分泌出来的内脏素在机体内如何作用于血管的内皮细胞，从而对冠脉的血管造成损伤，这些机制都在急性心肌梗死疾病的发生和发展起一定的作用，甚至可以推断控制内脏素分泌也许在早期预防急性心肌梗死患者能够起到十分重要的作用。但是如何去控制内脏素病理作用的这方面研究不多，这需要进行下一步的研究探讨，以发现更好的办法减少急性心肌梗死事件的发生。

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（收稿日期：2016-06-27） （本文编辑：郎威）