2型糖尿病肝纤维化大鼠中microRNA-29b的表达变化

汪丽娜，叶华山，郑 敏，寻亚慧

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院生物医学工程学院)



2型糖尿病肝纤维化大鼠中microRNA-29b的表达变化

汪丽娜1，叶华山2*，郑 敏2，寻亚慧1

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院生物医学工程学院)

目的 观察2型糖尿病大鼠成模前后肝组织中microRNA-29b的表达，探讨牛磺酸和microRNA-29b在小鼠肝纤维化中的作用机制。方法 将65只大鼠处理后分为正常组、糖尿病模型组和给药组(牛磺酸400mg/kg)。给药两个月后，称重，测血糖；取样称量肝重，计算肝脏系数；肝脏组织切片进行HE和Masson染色法；荧光定量PCR检测转化生长因子-β1(THF-β1)和miRNA-29b的表达变化。结果 与正常组比较，模型组肝脏系数增加，肝组织中TGF-β1水平升高，染色结果明显，miRNA-29b含量显著降低(P均<0.05)；与模型组比较，给药组肝脏系数降低(P<0.05)，大鼠肝组织中TGF-β1水平降低，miRNA-29b上调明显，纤维化较模型组减轻。结论 2型糖尿病小鼠肝纤维化可通过牛磺酸上调microRNA-29b起到一定的抑制作用。

2型糖尿病；肝纤维化；转化生长因子；牛磺酸

肝脏纤维化主要是细胞外基质过度沉积，尤其是在慢性病过程中容易引起肝脏纤维化病变，2型糖尿病是慢性病之一，其主要特征是血糖高，而高血糖明显促进肝纤维化发展[1]。天然牛磺酸可以减少过氧化物含量，增强SOD活性，对肝细胞线粒体、内质网等超微结构具有保护作用，对肝纤维化有保护作用[2]。四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型经牛磺酸处理后，无纤维组织沉积，能够抑制转化生长因子-β1和TβRI，明显抑制肝脏纤维化[3]，本研究就2型糖尿病大鼠肝纤维化模型中microRNA的表达情况进行检测并对牛磺酸抑制肝纤维化机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 牛磺酸购自武汉科瑞生物技术有限公司(Origin:USA，批号:15031809)；链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；Trizol购自Aidlab(Lot:252250AX)；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体(1∶50)购自武汉三鹰生物技术有限公司(货号:18978-1-ap)；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(货号:PV-9000)；浓缩型DAB试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号:DA1010)；三诺血糖仪和三诺血糖试纸购自长沙三诺生物传感技术有限公司。

1.2 实验动物 SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠，全部雄鼠，体质量(200±20)g，由湖北省实验动物研究中心提供[SPF级，许可证编号SYXK(鄂)2013-0071]。

1.3 方法

1.3.1 造模和给药 65只SD大鼠随机抽取17只作为正常组，其余作为糖尿病造模组。正常组大鼠喂养标准大鼠饲料，注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液对照，灌服等量生理盐水。糖尿病模型组大鼠喂养高糖高脂饲料，禁食12 h后，腹腔注射小剂量STZ (30 mg/kg，以pH 4.4的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，避光，现用现配)，注射第3d，禁食1晚，次日早8点尾尖取血，测血糖，选择血糖值大于11.1mmol/L的动物(30只)为造模成功的2型糖尿病大鼠模型(剔除死亡的和不成功的)。模型组和给药组(400mg/kg)，每组15只，两组持续喂饲高脂饲料。牛磺酸用生理盐水配制成混悬液，每天灌服1次，正常组与模型组灌服等量生理盐水，给药2个月。末次给药后，正常组死亡2只，剩余15只，取6只进行检测；模型组剩余5只，全部检测；给药组剩余8只，全部检测。动物禁食过夜，自由饮水，称重，10%水合氯醛(3.33mL/kg)麻醉大鼠，取肝组织称重，计算肝脏系数(肝重/体质量)。

1.3.2 检测指标和试验方法 使用相关试剂盒检测肝脏组织中microRNA-29b和TGF-β1mRNA水平，将剩余肝脏组织浸于4%的多聚甲醛溶液中固定，制备肝脏组织切片经HE染色、Masson染色。荧光定量PCR检测TGF-β1mRNA时以GAPDH为参照物，而microRNA-29b以U6为参照物。

荧光定量PCR引物序列表

2 结 果

2.1 大鼠血糖、体质量和肝脏系数 2型糖尿病大鼠造模成功后，经高脂饲料持续喂养2个月，取样时每组动物例数，血糖和肝脏系数明显升高，体质量明显降低，应用牛磺酸治疗后禁食血糖较模型组略有降低，体质量较模型组有所下降，对肝脏系数未见明显影响，见表1。

表1 各组大鼠的血糖，体质量和肝脏系数的比较±s)

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 肝脏组织HE染色和Masson染色 肝组织切片经HE染色和masson染色后，在显微镜下可见随肝组织不同程度纤维化，红色肝细胞中有不同量的蓝色纤维出现。正常组未见明显纤维化，肝细胞排列整齐；模型组大鼠胶原纤维组织明显增加，增多的胶原纤维形成纤维间隔，分割肝细胞，使排列整齐的肝细胞混乱，肝组织纤维化明显；给药组可见部分组织染蓝，局部纤维化，与模型组相比，蓝色减少，纤维化减轻，见图1(封二)。

Masson染色后，从每个样本的高倍镜视野采集图像随机选择5个，观察肝脏纤维变化程度，将纤维化程度分为5级。0级：肝组织结构无异常；1级：汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化；2级：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；3级：纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；4级：早期肝硬化[4]。下列表格表示每组肝脏染色后在纤维化程度级别下的样本量。可以很直观的看出每组肝纤维化程度的发生率和严重程度。见表2。

表2 Masson染色肝组织纤维化程度[n(%)]

2.3 肝组织TGF-β1 mRNA表达 荧光定量PCR结果见图2(a)、(b)，模型组较正常对照组相比TGF-β1 mRNA表达显著增加(P<0.05)；给药组较模型组相比TGF-β1 mRNA表达显著降低(P<0.05)。

图2 (a)、(b)荧光定量PCR检测肝组织中TGF-β1 mRNA

(c)、(d)荧光定量PCR检测肝组织中miRNA-29b

与正常组比较，**P<0.01、*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 肝组织中microRNA-29b的表达 分别检测各组大鼠肝脏中miRNA-29b的表达水平。结果如图2(c)、(d)所示，与正常组相比，miR-29b在模型组肝脏中的表达显著下调(P<0.05)，给药组与模型组比较miRNA-29b表达上调明显(P<0.05)。

3 讨 论

肝星状细胞在葡萄糖的刺激下可加快纤维胶原的增生，明显促进肝纤维化的形成，星状细胞激活转化生长因子等细胞因子，加快细胞外基质的累积[5-6]。TGF-β是组织纤维化过程中发挥关键作用的细胞因子，在纤维化中发挥重要作用[7]。microRNA通过调控目的基因参与各种生理病理过程，参与了肝组织纤维化的过程，上调miR-29b和下调TGF-β1相对地参与肝星状细胞的肝纤维化，且上调miR-29能够抑制PDGF-B和TGF-β旁路调控胶原纤维的生成[8-9]。

有研究发现牛磺酸对纤维化的防治作用，例如牛磺酸可通过下调TGF-β1的表达，抑制TGF-β/Smad3信号通路，减少ECM合成，增加ECM降解、减少促纤维化因子产生等，抑制结肠纤维化[10]。利用牛磺酸可减少胶原纤维I、Ⅲ的形成，改善异丙肾上腺素引起的大鼠心肌纤维化[11]。牛磺酸可抑制组织脂质过氧化的发生,对二氧化硅引起的大鼠矽肺纤维化有一定的防治作用[12]，而且牛磺酸在2型糖尿病模型中可改善成人血糖[13]，牛磺酸在降血糖方面也可能发挥一定的作用。

综上所述，从病理学角度观察到2型糖尿病肝纤维化模型建成后，其血糖升高，肝脏纤维化明显，HE及Masson染色结果明显出现肝纤维化病变。应用牛磺酸治疗2个月，禁食血糖较模型组略有降低，病理学检查显示肝组织胶原纤维减少，纤维化病变程度明显减轻。2型糖尿病大鼠肝脏TGF-β1表达较正常组增加，miRNA-29b的表达减少，应用牛磺酸治疗2个月后可见TGF-β1的含量显著降低，相应的，miRNA-29b的含量明显增加，肝纤维化的病变程度减轻。其机制可能是牛磺酸在肝脏中能增加microRNA-29b的水平从而降低TGF-β1的表达，减少细胞外基质的堆积和胶原的形成，同时还可能促进胶原和基质的降解，减轻肝脏纤维化病变。

[1]BAN C R,TWIGG S M.Fibrosis in diabetes complications:pathogenic mechanisms and circulating and urinary markers[J].Vasc Health Risk Manag,2008,4:575

[2]文彬，陈然，彭佩纯，等.天然牛磺酸对肝硬化大鼠肝脏超微结构及脂质过氧化的影响[J].中国全科医学，2015，18(6)：661

[3]邓鑫，梁健，黄彬，等.天然牛磺酸对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响[J].大连医科大学学报，2007，29(4)：336[4]中华肝脏病学会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识[J].药品评价，2007，4(4)：265

[5]PARADIS V,PERLEMUTER G,BONVOUST F,et al.High glucose and hyperinsulinemia stimulate connective tissue growth factor expression:a potential mechanism involved in progression to fibrosis in nonal coholic steatohepatitis[J].Hepatology,2001,10,34(4 Pt 1):738

[6]KISSELEVA T，BRENNER DA.Role of hepatic stellate cells in fibrogenesis and the reversal of fibrosis[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,6,22(Suppl 1): S73

[7]BOWEN T,JENKINS RH,FRASER DJ.MicroRNAs,transforming growth factor beta-1,and tissue fibrosis[J].J Pathol,2013,229(2):274

[8]KWIECINSKI M,NOETEL A,ELFIMOVA N,et al.Hepatocyte growth factor (HGF) inhibits collagen I and IV synthesis in hepatic stellate cells by miRNA-29 induction[J].PLoS ONE,2011,6(9):e24568

[9]MAURER B,STANCZYK J,JüNGEL A.MicroRNA-29,a key regulator of collagen expression in systemic sclerosis[J].Arthritis Rheum,2010,62(6):1733

[10]成家飞，林琳，宁月季，等.牛磺酸对三硝基苯磺酸诱导的结肠炎大鼠肠纤维化的抑制作用[J].中华消化杂志，2010，30(1)：28

[11]王侃，严文华，吕海涛.牛磺酸对心肌肥厚纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响[J].浙江实用医学，2010，15(5)：345

[12]陈静，李明，李超，等.牛磺酸对染矽尘大鼠肺组织纤维化的防治作用[J].现代预防医学，2014，41(7)：1270

[13]FRANCONI F,LOIZZO A,GHIRLANDA G,et al.Taurine supplementation and diabetes mellitus[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2006,9(1): 32

The Expression of MicroRNA-29b in Rats with Hepatic Fibrosis in Type 2 Diabetic Mellitus

WANG Li-na，YE Hua-shan，ZHENG Min，et al

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective The aim of this study was to survey the expression of microRNA-29b on the formation of hepatic in type 2 diabetic rats and explore the effect of microRNA and taurine on liver fibrosis.Methods 65 SD rats were divided into normal group,type 2 diabetes mellitus group and taurine group (400mg/kg).After the treatment of Taurine for two months,body weight,the liver weight,fasting blood glucose and the liver index were determined，HE and Masson staining were used to observe the degree of liver fibrosis,fluorescence quantitative PCR were employed to detect transforming growth factor beta1(TGF-β1) and the expression of microRNA-29b in liver tissue of rat.Results Compared with normal group,the liver coefficient and levels of TGF-β1 of liver tissue increased in model group(P<0.05).Dyeing results show that the fat cavitation and fibrosis of liver tissue of model group increased significantly.The result of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of miRNA-29b decreased markedly(P<0.05).Compared with model group，the liver coefficient of taurine group was decreased(P<0.05) and the level of TGF--1 in liver tissue of rats was decreased.microRNA-29b was increased significantly and the fibrosis was reduced.Conclusion The results suggest taurine may alleviate the formation of hepatic fibrosis to a certain extent in type 2 diabetes mellitus by up-regulating microRNA-29b.

Type 2 diabetes mellitus;Hepatic fibrosis;Transforming growth factor-β1;Taurine

，E-mail：yehuashan@126.com

R587.1

A

2095-4646(2016)05-0375-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0375

2016-04-05)