肿瘤坏死因子-α基因多态性及其血清水平与脑梗死的相关性

刘 丹 张 伟 孙洪英 董向力 王贵喜 贾 璐 李新辉 张 佳 杨 静

(包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古 包头 014010)



·心、脑血管及代谢性疾病·

肿瘤坏死因子-α基因多态性及其血清水平与脑梗死的相关性

刘 丹 张 伟 孙洪英 董向力 王贵喜 贾 璐 李新辉 张 佳 杨 静

(包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古 包头 014010)

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)-α T1031C多态性位点及血清水平与动脉粥样硬化性脑梗死的病情严重程度和发病风险的关系。方法 选择动脉粥样硬化性脑梗死患者(病例组)120例，健康者75例为对照组。采用限制性片段长度多态性分析技术，检测两组TNF-α T1031C多态的分布。采用酶联免疫吸附法(ELLSA)检测两组患者血清TNF-α水平。结果 病例组TNF-α T1031C的CC基因型、C等位基因频率明显高于对照组(P<0.05)。TNF-α T1031C的各基因型与脑梗死病情严重程度无相关性(P>0.05)。Logistic回归校正性别、年龄、吸烟、血糖、血压等因素后，TNF-α T1031C的CC基因型脑梗死发病风险明显增加(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)。病例组TNF-α血清水平明显高于对照组(P<0.05)。病例组和对照组TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平无显著差异(P>0.05)。结论 TNF-α基因 T1031C的CC基因型增加动脉粥样硬化性脑梗死的发病风险，C等位基因是脑梗死的遗传易感基因之一。

肿瘤坏死因子α；基因多态性；脑梗死；遗传易感性

动脉粥样硬化性脑梗死的病因复杂，遗传和环境因素在其发病过程中起重要的作用，其发病机制至今尚未完全明确，但目前认为脑缺血缺氧造成的能量代谢障碍、兴奋性神经介质释放、钙过量内流、自由基反应、细胞凋亡、炎症免疫反应等一系列缺血性连锁反应是导致缺血性脑损害的中心环节〔1〕。肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α作为最重要的免疫和炎症相关因子之一，广泛参与体内各种炎症和免疫应答过程。研究表明，血清TNF-α水平在脑梗死急性期增高，与脑梗死的发病、发生发展密切相关〔2～5〕。TNF-α基因多处位点存在多态性，有报道其基因多态性与冠心病、脑梗死等动脉粥样硬化性疾病和免疫疾病密切相关〔6～11〕，但TNF-α 基因T1031C多态性与脑梗死的相关研究未见报道。本文研究探讨TNF-α基因T1031C多态性、血清TNF-α水平与动脉粥样硬化性脑梗死的病情严重程度和发病风险的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年9月至2013年6月在我科连续住院的初发动脉粥样硬化性脑梗死(发病1 w之内)患者(病例组)120例，男73例，女47例，平均年龄(62.43±11.72)岁，不包括腔隙性脑梗死和脑栓塞患者，均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准，并经头颅CT或MRI检查证实。排除标准：严重感染、恶性肿瘤、结缔组织病以及1年内患组织损伤疾病如心肌梗死，重大外科手术及接受免疫抑制剂治疗者除外。同期选择健康体检者为对照组75例，男45例，女30例，平均年龄(61.69±9.68)岁。两组年龄(t=0.453，P=0.651)、性别(χ2=0.013,P=0.908)相比无统计学差异。所有入组者均知情同意，均为包头市长住居民、汉族、彼此无亲缘关系。

1.2 方法

1.2.1 血液标本收集与测定 病例组患者在入院第2天清晨06：00空腹采集静脉血4 ml和2 ml各1管，4 ml管离心后取血清，放于-30℃低温冰箱中保存待测TNF-α血清浓度，2 ml管置EDTA-Na2抗凝管中-30℃冰箱保存检测基因多态性。TNF-α血清水平检测方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒是美国R&D公司分装。操作过程按试剂盒说明。TNF-α基因 T1031C多态性采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测。对照组在体检当天亦空腹采血，保存和检测方法同上。

1.2.2 病例登记 对病例组患者和对照组进行登记。登记内容包括：①患者的一般资料(包括姓名、性别、年龄、职业、民族、住院号、地址、联系电话等)；②既往情况(既往病史及健康状况、吸烟饮酒史)；③住院情况〔包括入院日期、入院美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)评分、实验室血液学检验值、颈部血管超声、头颅影像结果、出院日期、并发症等〕。

1.3 基因型判定 采用PCR检测，PCR引物序列参照文献设计，由上海生工合成。TNF-α T1031C基因扩增引物序列为：上游引物：5'-TATGTGATGGACTCACCAGGT-3'，下游引物：5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3'，扩增产物为264 bp。反应体系为25 μl，其中模板DNA模板5 μl，PremixEx Taq DNA 聚合酶12.5(含Buffer，dNTP，MgCl2)，上游及下游引物各1 μl(10 pmol/L)，加无菌蒸馏水至25 μl。循环参数：94℃预变性5 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物分别经BbsⅠ限制性内切酶37℃水浴2 h后，进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后分析基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件行方差分析及χ2检验，采用Logistic回归分析基因型与脑卒中的发病关系。

2 结 果

2.1 两组临床资料、生化指标及血清TNF-α水平比较 与对照组比较，病例组吸烟者比例、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血小板水平、血清TNF-α水平增高(P<0.05)，总胆固醇(TC)水平虽增高，但差异未达到统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较±s)

2.2 两组TNF-α基因型鉴定 两组TNF-α T1031C基因型，分别为TT、TC、CC型，均以TT型为主，CC型最少。TNF-α T1031C的CC基因型(纯和突变型)为195 bp和69 bp两条片段，TC基因型(杂合型)为264 bp，195 bp和69 bp 3条片段，TT基因型(野生型)为440 bp 1条片段(图1)。

M:50 bp DNA ladder；1、2、3、5、7、8：TT型；4、6：TC型；10：CC型图1 PCR-BbsⅠ酶切的TNF-α 1031SNP基因型分型

2.3 两组TNF-α T1031C基因型和等位基因频数分布比较 两组人群TNF-α T1031C多态性基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。与对照组比较，病例组CC基因型和C等位基因频率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 病例组与对照组TNF-α T1031C基因型和等位基因频率〔n(%)〕

与对照组比较：1)P<0.05

2.4 TNF-α T1031C基因型与脑梗死病情严重程度的相关性 病例组根据NIHSS标准在入院第1天进行评分，分为轻型组(<4分)71例，中型组(4～10分)27例，重型组(>10分)22例。未发现TNF-α T1031C基因型与脑梗死病情严重程度存在相关性(χ2=7.486,P=0.112)，见表3。

表3 TNF-α T1031C基因型与脑梗死病情严重程度相关性〔n(%)〕

2.5 TNF-α T1031C不同基因型与脑梗死发病风险的关系 以脑梗死是否发生为因变量，以年龄、性别、吸烟史、FPG、DBP、SBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C和TNF-α T1031C基因型为自变量，进行多因素Logistic回归分析结果表明，TNF-α T1031C的CC基因型(OR=3.671，95%CI：10.26～13.135，P=0.046)、TC水平、LDL-C、FPG、SBP、TG显著增加脑梗死的发病风险(P<0.05)，是脑梗死发生的独立危险因素。

2.6 TNF-α T1031C基因型与TNF-α血清水平的相关性 两组TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平无显著差异(P>0.05)，见表4。

表4 不同TNF-α基因型患者TNF-α血清水平

3 讨 论

TNF-α是一种重要的具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子，主要是由激活的单核C巨噬细胞分泌产生的细胞因子〔12〕，TNF-α在活化的巨噬细胞内以膜结合型存在，并多以旁分泌或自分泌释放。在正常情况下，它具有抗肿瘤、抗感染和促进组织修复等作用，对机体有利。若持续释放，则会引起机体发热、休克、恶病质和组织损伤。因此它不仅是一种重要的免疫细胞因子，又是一种重要的炎性细胞因子〔13〕。近年研究表明，TNF-α与脑梗死、动脉粥样硬化、冠心病、免疫相关等疾病密切相关〔2～5〕，参与了这些疾病的发生发展。

人类TNF-α基因定位于人染色体6p21.1-p21.3，位于MHC Ⅲ类基因区内。TNF-α基因具有多态性，其多态性位点主要集中在其启动子区域的：-1031、-244、-308、-376、-49、-419、-163、-238、-857、-863等位点。目前关于其-308、-238 位点的多态性与疾病的研究较多，有报道TNF-α G308A及TNF-α G238A 多态性与动脉粥样硬化、脑梗死、冠心病的发生有关联〔6～9，14〕。

本研究结果提示，TNF-α基因T1031C多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的遗传易感性相关，C等位基因是动脉粥样硬化性脑梗死的遗传易感基因之一。推测，TNF-α基因的1031位点的碱基T被碱基C所替代，可能影响TNF-α的表达，从而促进脑梗死的发生发展。同时本研究首次对TNF-α基因 T1031C多态性与脑梗死病情严重程度进行分析后发现，TNF-α基因 T1031C多态性与脑梗死病情严重程度无相关性，也提示TNF-α基因 T1031C多态性可能对于内蒙古地区汉族人群的脑梗死病变程度没有影响。

本研究结果与曹红元等〔2～4〕研究结果一致，表明不论是病例组还是对照组，TNF-α T1031C各基因型的血清TNF-α水平无显著差异，这说明二者之间无相关性。

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〔2015-03-09修回〕

(编辑 安冉冉/曹梦园)

内蒙古自治区高等学校科学技术研究一般项目(No.NJZY13245)；包头市社会发展科技支撑项目(2012S2006-04-08)

刘 丹(1973-)，女，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事脑血管病基础与临床研究。

R743.3

A

1005-9202(2016)20-5002-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.026