CD44s、CD44v6、CD44v9在骨肉瘤、骨巨细胞瘤及骨软骨瘤标本的表达及临床意义

王志涛 杜珍武 张桂珍 王亚军

(吉林大学第二医院骨科，吉林 长春 130041)



CD44s、CD44v6、CD44v9在骨肉瘤、骨巨细胞瘤及骨软骨瘤标本的表达及临床意义

王志涛 杜珍武 张桂珍 王亚军

(吉林大学第二医院骨科，吉林 长春 130041)

目的 探究变异体CD44s、CD44v6及CD44v9与骨肉瘤分化、转移及恶性程度的关系。方法 通过qPCR技术检测10例骨肉瘤、8例骨巨细胞瘤、5例骨软骨瘤标本中变异体CD44s、CD44v6及CD44v9的表达水平，应用统计学方法进行数据处理，同时结合患者临床资料和病理资料进行相关性分析。结果 (1)CD44s、CD44v6在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中的表达明显高于骨软骨瘤(均P<0.05)，但在骨肉瘤和骨巨细胞瘤之间的表达无显著差异(均P>0.05)。(2)CD44v9在骨软骨瘤中无表达，在骨肉瘤和骨巨细胞瘤之间的表达无显著差异(P>0.05)。(2)CD44v9在低分化骨肉瘤表达高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，在转移性骨肉瘤表达高于非转移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s和CD44v6与骨肉瘤分化和转移无显著相关性(P>0.05)。结论 CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨肿瘤之间表达有差异。CD44s、CD44v6及CD44v9三者当中只有CD44v9的表达与骨肉瘤的分化和转移有相关性，并且分化和转移关系密切。CD44v9可作为判断骨肉瘤恶性程度的一个指标。

骨肉瘤；CD44s；CD44v6；CD44v9

骨肉瘤在所有原发于骨组织的恶性肿瘤中所占比例最高〔1〕，尽管手术加化疗已使非转移性骨肉瘤患者5年生存率由20%提升到60%〔2，3〕，但骨肉瘤极易发生转移，大约20%的患者在骨肉瘤确诊时已经出现了转移灶，另外80%的患者在手术治疗后发生了转移〔4，5〕。这些伴有转移的骨肉瘤患者，其5年生存率仍旧为20%〔6〕。CD44在骨肉瘤浸润和转移中发挥着重要作用〔7〕。CD44属于Ⅰ型跨膜糖蛋白家族，负责调控细胞与细胞及ECM间的相互作用〔8〕。CD44基因经选择性剪切和转录后修饰形成了多种CD44v，它们是CD44参与调控淋巴细胞激活、再循环及归巢、炎症反应和肿瘤转移等生物学功能的基础〔9〕，其中CD44s、v6和v9的反常表达与肿瘤的侵袭、转移及预后关系密切〔10～13〕。本实验拟探讨变异体CD44s、CD44v6及CD44v9与骨肉瘤分化、转移及恶性程度的关系。

1 材料与方法

1.1 对象 收集吉林大学第二医院2009年4月至2013年1月的骨肿瘤病理切片，由两名病理科医生独立诊断，同时结合临床资料确定肿瘤的转移情况。共收集到23例患者，其中骨肉瘤10例，男7例，女3例；年龄12～87岁，低分化6例、高分化4例，发生转移6例、无转移4例；骨巨细胞瘤8例，男女各4例，年龄26～54岁；骨软骨瘤5例，男3例，女2例；年龄9～73岁。患者临床资料完整，且术前未进行放、化疗。

1.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒“PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA ynthesis Kit”购自Takara公司，琼脂糖购自BIOWEST公司，TAE电泳液(50×)购自天恩泽公司，qPCR试剂盒“All-in-OneTMqPCR Mix”购自GeneCopoeia公司，定量PCR反应板购自BIOPLASTICS公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 CD44s、CD44v6及CD44v9引物序列参考文献〔14〕，序列：CD44s上游引物5′-GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC-3′，下游引物5′-GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC-3′；CD44v6上游引物5′-CCAGGCAACTCCTAGTAGTACAACG-3′，下游引物5′-CGAATGGGAGTCTTCTTTGGGT-3′；CD44v9上游引物5′-AGCAGAGTAATTCTCAGAGC-3′，下游引物5′-TGATGTCAGAGTAGAAGTTGTT-3′；β-actin上游引物5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′，下游引物5′-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。引物由上海赛百盛公司合成。

1.3.2 标本组织切片RNA提取 标本组织RNA提取方法参照文献〔15〕。主要步骤：①取切片3张，浸于二甲苯5 min，无水乙醇洗涤两遍，自然晾干；②在切片上滴加组织裂解缓冲液(20 mmol/L Tris，pH8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；2% SDS，pH7.2)，将切片上组织刮入1.5 ml离心管内，加组织裂解缓冲液250 μl混匀，加入蛋白酶K(终浓度400 mg/L)，置于58℃消化至液体清亮，消化后的组织置于 95℃10 min。③加Trizol 1 ml，按Trizol试剂说明书进行RNA 提取。将提取到的RNA进行含量、纯度及完整性检测，-80℃保存备用。

1.3.3 标本RNA逆转录 取标本RNA 3 μl，按照逆转录试剂盒说明书将各标本RNA逆转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.3.4 实时荧光定量PCR 每孔反应体系共计20 μl，包括标本cDNA 1 μl，“2×All-in-one qPCR Mix”10 μl，上下游引物各0.5 μl，“50×RoxReference Dye”0.4 μl，去RNase水7.6 μl。反应条件为95℃ 3 min初变性，然后95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共计40个循环，随后72℃延伸3 min。应用IDEAS软件计算出CT值，应用2-△△CT方法计算各基因在标本中表达的相对定量。

1.4 统计分析 应用SPSS19软件行方差分析和独立样本t检验。

2 结 果

2.1 CD44s在各组标本中的表达 CD44s在骨肉瘤组和骨巨细胞瘤组的相对表达量高于骨软骨瘤组(P<0.05)，而在骨肉瘤组和骨巨细胞瘤组表达无显著差异(P>0.05)。

2.2 CD44v6在各组标本中的表达 CD44v6在骨肉瘤组和骨巨细胞瘤组表达量高于骨软骨瘤组(均P<0.05)，而在骨肉瘤组和骨巨细胞瘤组无显著差异(P>0.05)。

2.3 CD44v9在各组标本中的表达 CD44v9在骨软骨瘤组无表达，而在骨肉瘤组和骨巨细胞瘤组的表达量无显著差异(P>0.05)。

2.4 CD44s、CD44v6和CD44v9的表达与骨肉瘤分化的相关性 CD44v9在低分化骨肉瘤表达的相对定量高于高分化骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6无类似相关性，见表1。

2.5 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤标本中的表达与转移的相关性 CD44v9在转移性骨肉瘤表达量高于非转移性骨肉瘤(P<0.05)，而CD44s、CD44v6无类似相关性，见表2。

表1 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤低分化组和高分化组的表达±s)

与低分化组相比：1)P<0.05

表2 CD44s、CD44v6和CD44v9在骨肉瘤转移组和非转移组的表达±s)

与转移组比较：1)P<0.05

3 讨 论

CD44s是CD44变异体标准型。彭挺生等〔16〕的研究表明相比骨纤维结构不良标本，CD44s在骨肉瘤中的表达水平显著升高，CD44s的表达与骨肉瘤的分化呈负相关，并且其表达水平越高越容易出现肺部转移。笔者同样分析了CD44s表达与骨肉瘤分化和转移的相关性，但未发现类似相关性。Kim等〔17〕应用免疫组化检测50例骨肉瘤标本中CD44s、CD44v5、CD44v6的表达水平，结果未发现CD44s的表达与分化和转移有明显相关性，与本的研究结果相似。

CD44v6是研究较早的一种CD44v。陈雷等〔18〕应用免疫组化研究结果证实，相较骨软骨瘤及正常骨组织，CD44v6 在骨肉瘤中的表达显著升高，但与预后无显著相关性，CD44v6可作为判断骨肉瘤恶性程度的指标。林建华等〔19〕采用免疫组化实验，结果表明相较骨软骨瘤和正常骨组织，MMP-9及CD44v6在骨肉瘤的表达水平明显升高，两者表达呈正相关，作者认为通过联合检测患者病理标本中MMP-9及CD44v6的表达可以判断骨肉瘤的恶性程度。辛榕等〔20〕研究表明相比骨软骨瘤，CD44、CD44v3和v6在骨肉瘤的表达显著升高，并且CD44v6的表达水平最高，CD44V6可以作为诊断骨肿瘤恶性表型的标志。笔者实验同样证实相比骨软骨瘤，CD44v6在骨肉瘤和骨巨细胞瘤的表达水平显著升高，但未发现CD44v6的表达与骨肉瘤分化和转移有明显相关性，因此CD44v6不能作为骨肉瘤恶性程度的标志。

有关CD44v9与骨肉瘤关系的研究较少。高文〔21〕采用免疫组化发现CD44v9在骨肉瘤的表达水平高于另外两者，并且在骨软骨瘤中阳性表达率为0。本实验同样证实CD44v9在骨肉瘤的表达高于骨软骨瘤且CD44v9在骨软骨瘤中无表达，但未能证明CD44v9在骨肉瘤的表达高于骨巨细胞瘤。另外笔者发现CD44v9的表达与骨肉瘤分化和转移有关张翠萍等〔22〕应用RT-PCR技术检测CD44v9在结直肠癌组织中的表达，发现CD44v9与结直肠癌的转移性有关。李志高等〔23〕应用免疫组化技术检测发现CD44v9的表达与大肠癌分化和转移有关：CD44v9表达随大肠癌分化程度降低而升高，在伴有转移的大肠癌中表达高于非转移大肠癌中的表达。以上两次研究均证实CD44v9可以成为判断肿瘤恶性程度的重要生物学标志，与本实验结论相似。

综上所述，CD44s、CD44v6及CD44v9在不同骨肿瘤之间表达有差异。CD44s、CD44v6及CD44v9三者当中只有CD44v9的表达与骨肉瘤的分化和转移有相关性，并且分化和转移关系密切。CD44v9可作为判断骨肉瘤恶性程度的一个指标。

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〔2016-07-20修回〕

(编辑 曲 莉)

王亚军(1960-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事骨与关节、 四肢创伤临床研究。

王志涛(1989-)，男，在读硕士，主要从事骨与关节、 四肢创伤临床研究。

R68

A

1005-9202(2016)20-4998-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.024