陕西省12种中药饮片微生物污染调查及风险评估

绳金房，杨晓莉，李 辉

(陕西省食品药品检验所，西安 710065)



陕西省12种中药饮片微生物污染调查及风险评估

绳金房，杨晓莉，李 辉

(陕西省食品药品检验所，西安 710065)

目的 调查陕西省12种常见中药饮片的微生物污染状况，并评估其潜在风险。方法 按照《中国药典》2015年版和《食品安全国家标准》方法对金银花等12种中药饮片进行需氧菌总数(TAMC)、霉菌和酵母菌总数(TYMC)、耐热菌数及控制菌检查。结果 中药饮片TAMC>104cfu·g-1的为70%(84/120)，TYMC>102cfu·g-1的为65%(78/120)，耐热菌数>102cfu·g-1的为49.2%(59/120)，预培养处理有助于耐胆盐革兰阴性菌的检出，为75.0%(90/120)，大肠埃希菌的检出率为3.33%，铜绿假单胞菌的检出率为7.5%。结论 中药饮片微生物污染情况比较严重，卫生质量亟待提高，应建立合理的微生物质量控制标准。

中药饮片；微生物污染；大肠埃希菌；铜绿假单胞菌；风险评估

中药饮片是中医药的重要特色和优势之一，目前其质量控制是中药质量控制的薄弱环节[1]，中药饮片既是生产中成药的原料，也可以经过煎煮等简单处理直接用于患者。如何在中药的发展过程中形成独特的微生物限度质量控制标准，既能有效地保证药品的安全性，又可以避免企业采用过度辐射灭菌的方法使其符合质量控制标准，是目前面临的最大挑战[2]。目前美国药典(USP38)、欧洲药典(EP8.0)和日本药局方(JP16)均收载了中药饮片的微生物质量控制标准[3-5]，《中国药典》2015年版四部通则1 107非无菌药品微生物限度标准亦首次收载了中药饮片的微生物限度标准[6]，但仅对研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片要求不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐革兰阴性菌应少于104(1g)，而对其他中药饮片及指标未作规定。

本文对陕西省不同区域、不同炮制方式、不同品种和不同来源的金银花、百合、龙骨、合欢皮、白术、煅牡蛎、夏枯草、鸦胆子、重楼、姜黄、穿心莲和海螵蛸等12个品种共120批中药饮片进行污染微生物的调查研究，以上品种均为常用口服兼外用中药饮片，除龙骨因中药资源保护未收载外，其余品种均收载于《中国药典》2015年版一部。按照《中国药典》2015年版及食品安全国家标准要求对需氧菌总数(TAMC)、霉菌和酵母菌总数(TYMC)、耐热菌和控制菌进行检验[7-8]，基本掌握了12种常用中药饮片的微生物污染现状，了解中药饮片潜在的微生物安全风险，为中药饮片的微生物污染风险评估和微生物质量控制标准的建立提供依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器HFsafe-1200LC型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；SHA-C型水浴恒温振荡器(北京中兴伟兴仪器有限公司)；LRH-250F生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；LRH-250F霉菌培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；LRH-150B生化培养箱(广东省医疗器械厂)；DK-98-1恒温水浴锅(天津泰斯特仪器公司)；VITEK2全自动微生物鉴定系统(法国梅里埃有限公司)；OLYMPUS.CH型三目显微镜(日本奥林巴斯公司)；涡旋混合器(常州国华电器有限公司)。

1.2 试药 样品覆盖西安、榆林、商洛、铜川和汉中，涉及生产企业、零售药店、医院药房和药材批发市场，见表1。

表1 中药饮片采集信息

Tab.1SamplinginformationofChineseherbalmedicines

序号品种性状数量/批炮制方式包装1金银花花10净制袋装/散装2合欢皮皮10切制袋装/散装3海螵鞘动物10掰块袋装/散装4夏枯草全草10净制袋装/散装5姜黄根10切制袋装/散装6百合花10切丝袋装/散装7重楼根10切制袋装/散装8白术根10切制袋装/散装9穿心莲茎叶10切制袋装/散装10鸦胆子果实种子10净制袋装/散装11龙骨动物10打碎袋装/散装12牡蛎动物10煅制袋装/散装

1.3 培养基 胰酪大豆胨液体培养基(TSB)等培养基适用性检查均符合《中国药典》2015年版和食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB4789.28-2013的规定。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 称取25g样品，加入pH值为7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液225mL，振荡10min，制成1/10供试品溶液。

2.2TAMC、TYMC和耐热菌的测定方法 取1/10供试品溶液及5个连续10倍稀释级，以TSA倾注法(1mL/皿)测定TAMC；取1/10供试品溶液及3个连续10倍稀释级以SDA(培养基中含庆大霉素活性成分最终质量浓度0.1g·L-1)倾注法(1mL/皿)测定TYMC，另取1/10供试品溶液经100 ℃水浴处理30min后，按照上述TAMC计数方法测定耐热菌数。

2.3 控制菌检查 按照《中国药典》2015年版四部通则1106要求，分别检查耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌和白色假丝酵母菌。按照《食品安全国家标准》进行志贺氏菌和溶血性链球菌检查。耐胆盐革兰阴性菌定性实验阳性结果的样品，重新取供试品，剪碎，加TSB，浸泡，振摇，制成1/10的供试品溶液，按照定量实验方法准确定量，并平行比较TSB预培养2h和不预培养直接测定耐胆盐革兰阴性菌定量结果的差异。

2.4 菌落鉴定 对实验中分离得到的疑似菌落进行分离纯化和显微鉴别，并进行VITEK2全自动微生物系统的分析、鉴定，以确证污染菌的种类及名称。

3 实验结果

实验原始数据对数转换，规定计数实验中TAMC或TYMC>107cfu·g-1，对数值计为7.0；TYMC或耐热菌数<10cfu·g-1，对数值计为0.5；耐胆盐革兰阴性菌N>105，对数值计为5.0；N<10，对数值计为0.5。定量结果采用SPSS19.0软件对数据统计分析，对定性结果归纳分析。

3.1 微生物计数结果 见表2。

表2 12种中药饮片平均染菌量对数转换结果

Tab.2Theaveragemicrobialcontaminationlogarithmconversionresultsof12kindsofChineseherbalmedicines

名称TAMCTYMC耐热菌耐胆盐革兰阴性菌未预培养预培养2h金银花3.521.771.201.551.70合欢皮5.772.851.863.603.55海螵鞘6.213.793.062.103.35夏枯草6.323.552.224.754.70姜黄4.472.452.160.802.15百合3.772.161.550.701.20重楼5.253.171.863.303.45白术3.341.711.400.600.80穿心莲5.573.313.013.554.00鸦胆子6.464.083.914.304.40牡蛎5.292.092.963.153.75龙骨3.061.841.831.402.35

3.1.1TAMC结果TAMC>108cfu·g-1的样本为12.5%(15/120)，TAMC>104cfu·g-1的样本为70%(84/120)，TAMC平均染菌量鸦胆子最高，龙骨最低。通过对典型菌落的分离和鉴定分析，阴沟肠杆菌、藤黄微球菌、松鼠葡萄球菌和放射根瘤菌等微生物污染饮片情况较为普遍。

3.1.2TYMC结果TYMC>105cfu·g-1的样本为4.2%(5/120)，TYMC>102cfu·g-1的样本为65%(78/120)，TYMC平均染菌量鸦胆子最高，白术最低。霉菌和酵母菌总数主要表现为品种差异，鸦胆子、夏枯草和海螵蛸污染严重，而金银花、白术和龙骨相对较少。

3.1.3 耐热菌数结果 耐热菌数>105cfu·g-1的样本为6.7%(8/120)，耐热菌>102cfu·g-1的样本为49.2%(59/120)，耐热菌平均染菌量中，鸦胆子最高，金银花最低。对耐热菌落分离、纯化和鉴定多为缓慢葡萄球菌和变异库克菌等。

3.1.4 耐胆盐革兰阴性菌结果 未预培养处理的耐胆盐革兰阴性菌检出为61.7%(74/120)，预培养2h处理的耐胆盐革兰阴性菌检出为75.0%(90/120)，见表3。

表3 耐胆盐革兰阴性菌结果频数分布

Tab.3ThefrequencydistributiontableofbilesaltresistantGram-negativebacteriadetection

结果范围未预培养批数百分率/%预培养2h批数百分率/%101053428.34033.3N<104638.33025.0合计120100.0120100.0

3.2 计数结果分析

3.2.1 预培养对耐胆盐革兰阴性菌结果影响分析 耐胆盐革兰阴性菌，预培养2h后检出率提高13.3%，采用转换后的对数值，进行t检验，结果P<0.05，差异有统计学意义，预培养2h可以提高耐胆盐革兰阴性菌的检出率。

3.2.2 聚类结果分析TAMC、TYMC、耐热菌及耐胆盐革兰阴性菌的聚类分析结果表明，花类的金银花、百合等，根茎类的白术、姜黄等因其抑菌作用[9-12]，微生物负荷相对较低，而其他根茎类、全草类、种子类及动物药的微生物负荷较高。

3.3 控制菌检查结果 对样本中的疑似菌落进行鉴定，结果见表4。结果表明，铜绿假单胞菌的检出率最高，检出9批，为7.5%；其次是大肠埃希菌，检出4批，为3.33%；其余控制菌均未检出。12种中药饮片普遍存在的其他污染菌中，以肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和缓慢葡萄球菌较为常见，从中药饮片中分离鉴定确认肺炎克雷伯菌和肺炎亚种菌等26种不同污染微生物。

表4 12种中药饮片控制菌检查结果

Tab.4 12kindsofChineseherbalmedicinescontrolbacteriatestresults

名称大肠埃希菌铜绿假单胞菌沙门菌金黄色葡萄球菌梭菌志贺氏菌白色假丝酵母菌溶血性链球菌其他污染菌金银花10000000阴沟肠杆菌合欢皮10000000缓慢葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,阴沟肠杆菌,巴斯德菌属海螵鞘01000000产气肠杆菌,溶血葡萄球菌夏枯草00000000肺炎克雷伯菌,光滑假丝酵母菌,假单胞菌姜黄01000000阴沟肠杆菌,嗜热链球菌,缓慢葡萄球菌,耐久肠球菌,假单胞菌百合01000000没有或未分离出其他污染菌重楼10000000施氏假单胞菌,变异库克菌白术01000000铅黄肠球菌,缓慢葡萄球菌,阴沟肠杆菌,溶血葡萄球菌穿心莲11000000放射根瘤菌鸦胆子01000000肺炎克雷伯菌,产气肠杆菌,阴沟肠杆菌牡蛎00000000阴沟肠杆菌,托尔蒙特链球菌,郝氏埃希菌,松鼠葡萄球菌龙骨03000000产气肠杆菌,溶血葡萄球菌,里拉微球菌,变异库克菌,狗链球菌共计49000000没有或未分离出其他污染菌

3.4 风险评估结果 按照USP38判定不合格率最高，而EP8.0不合格率最低。中药饮片微生物污染品种差异大，合欢皮、夏枯草、重楼、鸦胆子和穿心莲需氧菌总数污染较严重，而金银花、百合相对较好；植物药易于霉变，动物药如龙骨、牡蛎相对较好。污染微生物的种类方面，肠杆菌科微生物占首位，包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等。用药途径方面，外用的中药饮片应重视铜绿假单胞菌的控制，口服中药饮片应重视大肠埃希菌的控制。见表5。

表5 不同标准对12种中药饮片微生物指标的风险评估结果

Tab.5Theriskassessmentresultsof12kindsofChineseherbalmedicinesbydifferentstandards

标准名称分类限度标准不合格批数不合格率/%涉及不合格品种EP8.0A类TAMC≤107cfu·g-11512.5合欢皮、夏枯草、重楼、鸦胆子、穿心莲TYMC≤105cfu·g-154.2夏枯草、鸦胆子沙门菌不得检出(10g)00-大肠埃希菌≤103MPN/g4--JP16Ⅰ类TAMC≤107cfu·g-11512.5合欢皮、夏枯草、重楼、鸦胆子、穿心莲TYMC≤104cfu·g-13025.0除白术、牡蛎、龙骨外,全部涉及沙门菌不得检出(10g)0--大肠埃希菌≤102MPN/g4--USP38使用前经沸水处理的植物药TAMC≤106cfu·g-13327.5除金银花、姜黄、白术、百合、龙骨外,全部涉及TYMC≤104cfu·g-13025.0除白术、牡蛎、龙骨外,全部涉及耐胆盐革兰阴性菌≤102cfu7764.2全部涉及大肠埃希菌和沙门菌不得检出(10g)4--Ch.P2015研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片沙门菌不得检出(10g)---耐胆盐革兰阴性菌<104cfu(1g)4638.3除白术外,全部涉及

注：-表示检验取样量与标准要求不一致，不作判定。

4 讨论

中药抗菌成分主要有黄酮类、生物碱类、有机酸类、挥发油类、糖类、皂苷类、蒽醌类和萜类等[13]，采用pH值为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液可缓冲有机酸和生物碱，减小抑菌作用,有利于微生物的检出。有文献报道[14-17]，夏枯草、鸦胆子、金银花、穿心莲、白术和重楼对细菌有不同程度的抑制作用，夏枯草、姜黄、重楼和白术对霉菌和酵母菌有抑菌作用。从调查结果看，即使有抑菌作用的中药饮片，对污染微生物数量和种类的抑制也较微弱。可能的原因一方面是微生物负荷较大，掩盖了其抑菌作用；另一方面是中药饮片抑菌成分提取方法差异较大，主要为水煎剂，生理盐水、醋和酒等浸出剂，提取的极性范围较窄，可能导致有效成分未能完全提取[18]，影响了活性成分的种类、数量以及中药饮片的抑菌效果。此外，不同产地的中药饮片其抑菌作用差异也较大[19]。

中药饮片的质量控制备受关注[20]。调查显示，中药饮片微生物污染情况比较严重，卫生质量亟待提高。有文献报道，药品经营企业和使用单位均为不合格中药材的高发单位[21]。建议应尽快制定适合我国国情的中药饮片微生物限度标准，即：以易污染的致病菌为主，以反映整体卫生状况需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数为辅的中药饮片微生物限度检查标准。加强过程控制，逐步规范中药饮片生产的各环节，降低微生物负荷，减少不合理辐照，降低中药饮片的安全风险，促进中药饮片产业的健康发展。

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Investigation and risk assessment of 12 kinds of Chinese herbal medicines microbial contamination in Shaanxi province

SHENGJinfang,YANGXiaoli,LIHui

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi′an710065，China)

ObjectiveToinvestigate12kindsofChineseherbalmedicinesmicrobialcontaminationandassesspotentialrisk.MethodsAccordingtothemethodsofChinesePharmacopoeia2015editionandnationalfoodsafetystandard.12kindsofChineseherbalmedicineswereevaluatedforthedeterminationoftotalaerobicmicrobialcount(TAMC),totalcombinedyeastsandmoldscount(TYMC),totalheatresistantbacteriacountandthecontrolbacteria.ResultsChineseherbalmedicineTAMC>104cfu·g-1was70%(84/120),TYMC>102cfu·g-1was65%(78/120),heatresistantbacterianumber>102cfu·g-1was49.2%(59/120).PreprocessingbenefitedbilesaltresistantGram-negativebacteriadetection,whichwas75.0%(90/120). E.colidetectionratewas3.33%,Pseudomonas aeruginosadetectionratewas7.5%.ConclusionMicrobialcontaminationsituationofChineseherbalmedicineswasserious,itisnecessarytoimprovethesanitaryconditions,andestablishreasonablemicrobialqualitycontrolstandards.Keywords：Chineseherbalmedicine;microbialcontamination;E.coli.; Pseudomonas aeruginosa;riskassessment

陕西省科学技术研究发展计划项目(编号：S2013SF3711)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.017

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A

2016-02-26)