高效液相色谱法同时测定丹参中6种化学成分的含量

程茜菲

(陕西国际商贸学院，咸阳 712046)



·中药及天然药物·

高效液相色谱法同时测定丹参中6种化学成分的含量

程茜菲

(陕西国际商贸学院，咸阳 712046)

目的 建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定丹参中迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量的方法。方法 采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以甲酸水和乙腈进行梯度洗脱；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长为270 nm。结果 迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的线性范围分别为：0.336～3.36 μg(r=0.999 9)，4.772～47.72 μg(r=0.999 8)，0.019 3～0.192 8 μg(r=0.999 8)，0.072～0.72 μg(r=0.999 7)，0.077 2～0.772(r=0.999 8)和0.174 4～1.744 μg(r=0.999 9)；平均加样回收率分别为：100.2%，100.4%，98.6%，100.0%，99.3%和99.1%，RSD值分别为1.58%，1.25%，1.09%，1.21%，1.10%和1.06%。结论 该法同时测定了丹参中迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA6种化学成分的含量，结果准确可靠。

丹参；迷迭香酸；丹酚酸B；二氢丹参酮Ⅰ；隐丹参酮；丹参酮Ⅰ；丹参酮ⅡA；高效液相色谱法

A.stract:Objective To establish a method for the simultaneous determination of rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydrotanshinone Ⅰ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA in RadixSalviaemiltiorrhiza. Methods The chromatograhic separation was performed on Thermo C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)； the column temperature was maintained at 30 ℃；the separation was achieved by a linear gradient elution;the moblie phase was a mixture of solvent A(acetonitrile) and solvent B(formic acid aqueous).The flow rate was 1 mL·min-1；the UV detection wavelength was 270 nm. Result Rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydro-tanshinone Ⅰ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA showed good linearity in the ranges of 0.336-3.36 μg(r=0.999 9)，and 4.772-47.72 μg(r=0.999 8)，0.019 3-0.192 8 μg(r=0.999 8)，0.072-0.72 μg(r=0.999 7)，0.077 2-0.772 μg(r=0.999 8)，and 0.174 4-1.744 μg(r=0.999 9)，respectively.The average recoveries were 100.2%(1.58%)，100.4%(1.25%)，98.6%(1.09%)，100.0%(1.21%)，99.3%(1.10%)，and 99.1%(1.06%)，respectively.Conclusion The present method is simple and has satisfactory efficacy；it could be used for simultaneously determing rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydrotanshinoneⅠ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA components inSalviamiltiorrhiza.

丹参为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效[1]。丹参中主要含有水溶性的酚酸类和脂溶性的二萜醌类化学成分。现代药理学研究表明，丹参中的酚酸类和二萜醌类成分均具有显著的生理活性[2-4]。本文中水溶性成分迷迭香酸[5]、丹酚酸B[6]和脂溶性成分隐丹参酮[7]、二氢丹参酮Ⅰ[8]、丹参酮Ⅰ[9]、丹参酮ⅡA[10-11]经药理学研究发现药理活性较好，由于《中国药典》(2010年版)中以丹酚酸B和丹参酮ⅡA2个指标评价丹参质量的优劣，有一定的片面性，因此以多个指标评价丹参质量优劣更有说服力。本实验采用梯度洗脱法，建立了同时测定丹参中迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA等6种化学成分的方法，该方法简便、准确、重复性好，可为丹参药材的质量评价提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695-2996高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)；Empower色谱工作站；FA1104B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；KQ-500DB超声波清洗机(上海越众仪器设备有限公司)。

1.2 试药 迷迭香酸(中国食品药品检定研究院，批号111871-201404)；丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，批号111562-201514)；二氢丹参酮Ⅰ(宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号20121209)；隐丹参酮(中国食品药品检定研究院，批号110852-200806)；丹参酮Ⅰ(宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号20121007)；丹参酮ⅡA(中国食品药品检定研究院，批号110766-201520)。丹参药材分别产自四川(DS1，购自四川)和河南(DS2，购自郑州；DS3，购自西安)，经本实验室鉴定为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根茎。乙腈为色谱纯(Fisher公司)；水为娃哈哈纯净水；甲酸(西安鑫宝佳业化工有限公司，分析纯)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水(0.4 mL·L-1)，梯度洗脱：0～15 min：10%～25%A；15～25 min：25%～26%A；25～40 min：26%～43%A；40～60 min：43%～74%A；60～65 min：74%～84%A；65～70 min：84%～85%。流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为270 nm；进样量为10 μL；供试品溶液和混合对照品溶液色谱图见图1。

图1 HPLC图

A.供试品溶液；B.混合对照品；1.迷迭香酸；2.丹酚酸B；3.二氢丹参酮Ⅰ；4.隐丹参酮；5.丹参酮Ⅰ；6.丹参酮ⅡA

Fig.1 HPLC chromatograms

A.sample；B.control；1.rosmarinic acid；2.salvianolic acid B；3.dihydro tanshinone Ⅰ；4.cryptotanshinone；5.tanshinone Ⅰ；6.tanshinone ⅡA

2.2 混合对照品溶液的制备 取对照品迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA适量，精密称定，加入体积分数为80%的乙醇，使其完全溶解，分别制得对照品溶液。分别精密吸取各溶液适量，加体积分数为80%的乙醇，稀释至1 mL含迷迭香酸168 μg、丹酚酸B 2 386 μg、二氢丹参酮Ⅰ9.64 μg、隐丹参酮36 μg、丹参酮Ⅰ38.6 μg、丹参酮ⅡA 87.2 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末0.5 g，精密称定，置于25 mL具塞锥形瓶中，精密加入10 mL体积分数为80%的乙醇，称定质量，超声提取45 min，放至室温，再称定质量，用体积分数为80%的乙醇补足减失的质量。摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性范围考察 将混合对照品溶液分别精密吸取2，4，8，10，15和20 μL，按照2.1项下色谱条件进行测定。横坐标(X)为进样量，纵坐标(Y)为峰面积，进行线性回归，得回归方程。迷迭香酸：Y=1 000 000X+1 003.3，r=0.999 9，在0.336～3.36 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；丹酚酸B：Y=787 522X-10 672，r=0.999 8，在4.772～47.72 g范围内与峰面积呈良好的线性关系；二氢丹参酮 Ⅰ：Y=3 000 000X-1 278.8，r=0.999 8，在0.019 3～0.192 8 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；隐丹参酮:Y=5 000 000X-4 700.8，r=0.999 7，在0.072～0.72 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；丹参酮 Ⅰ：Y=2 000 000X-11 182，r=0.999 8，在0.077 2～0.772范围内与峰面积呈良好的线性关系；丹参酮ⅡA：Y=5 000 000X+591.44，r=0.999 9，在0.174 4～1.744 μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验 吸取混合对照品溶液适量，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，测得迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA6个对照品峰面积的RSD值分别为0.96%，0.39%，0.85%，0.50%，0.43%和0.30%，结果表明，该系统精密度良好。

2.6 稳定性实验 取样品溶液(四川产丹参)，在0，2，4，8，12和24 h，按照2.1项下方法进行测定，测得6个对照品峰面积的RSD值分别为1.01%(迷迭香酸)，1.55%(丹酚酸B)，0.76%(二氢丹参酮Ⅰ)，1.22%(隐丹参酮)，0.69%(丹参酮Ⅰ)和0.41%(丹参酮ⅡA)，结果表明，该溶液24 h内较稳定。

2.7 重复性实验 称取样品粉末(四川产丹参)0.5 g，精密称定6份，按照2.3项下方法进行制备，按照2.1项下色谱条件进样，测得样品中6种化学成分含量的RSD值分别为1.26%(迷迭香酸)，1.36%(丹酚酸B)，0.80%(二氢丹参酮Ⅰ)，0.73%(隐丹参酮)，0.53%(丹参酮Ⅰ)和0.67%(丹参酮ⅡA)，结果表明，该方法重复性较好。

2.8 加样回收实验 取样品粉末(DS1，已知含量)0.5 g，精密称定6份，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，再分别加入适量迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA对照品，精密加入20 mL体积分数为80%的乙醇，按照2.3项下方法制备溶液，按照2.1项下色谱条件进样，结果测得迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA回收率分别为100.2%(RSD值为1.58%)，100.4%(RSD值为1.25%)，98.6%(RSD值为1.09%)，100.0%(RSD值为1.21%)，99.3%(RSD值为1.10%)和99.1%(RSD值为1.06%)，结果见表1。

表1 加样回收率结果

Tab.1 Results of recovery test

成分称样量/g样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%迷迭香酸0.50121.002400.841.85248101.2100.201.580.50411.008200.841.8381298.80.50221.004400.841.86036101.90.50341.006800.841.8434499.60.50261.005200.841.8292498.10.50161.003200.841.85664101.6丹酚酸B0.501225.9600023.5849.68148100.6100.41.250.504126.1100023.5849.3598898.60.502226.0100023.5849.87296101.20.503426.0800023.5849.4713699.20.502626.0300023.5849.72790100.50.501625.9800023.5850.03160102.0二氢丹参酮Ⅰ0.50120.100240.110.2072797.398.61.090.50410.100820.110.21104100.20.50220.100440.110.2085798.30.50340.100680.110.2101399.50.50260.100520.110.2082197.90.50160.100320.110.2084598.3隐丹参酮0.50120.200480.200.40328101.4100.01.210.50410.201640.200.4006499.50.50220.200880.200.3976898.40.50340.201360.200.3995699.10.50260.201040.200.40244100.70.50160.200640.200.40284101.1丹参酮Ⅰ0.50120.150360.690.8320898.899.31.100.50410.151230.690.85020101.30.50220.150660.690.8296298.40.50340.151020.690.8389599.70.50260.150780.690.8304398.50.50160.150480.690.8328998.9丹参酮ⅡA0.50120.501200.430.9269099.099.11.060.50410.504100.430.9250797.90.50220.502200.430.9240398.10.50340.503400.430.9303999.30.50260.502600.430.93604100.80.50160.501600.430.9290299.4

2.9 样品含量测定 取不同批号丹参药材粉末0.5 g，精密称定，按照2.3项下方法制备供试品，按照2.1项下色谱条件进样，结果见表2。

表2 6种化合物的含量测定结果

Tab.2 Determination results of 6 compounds

样品编号迷迭香酸/%丹酚酸B/%二氢丹参酮Ⅰ/%丹参酮Ⅰ/%隐丹参酮/%丹参酮ⅡA/%DS10.205.180.020.030.040.10DS20.294.050.060.060.050.11DS30.284.460.030.070.030.08

3 讨论

3.1 提取条件的选择 对样品的制备方法进行分析，先对不同溶剂、相同溶剂不同体积分数进行考察选取提取溶剂，再对提取方法、提取时间进行研究，最终确定制备方法为用体积分数为80%的乙醇超声提取45 min。

3.2 流动相的选择 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水和乙腈-磷酸水等溶剂系统作为流动相，最终采用乙腈-甲酸水溶剂系统洗脱，丹参药材中6种化学成分具有良好的分离效果和较好的峰形。

3.3 检测波长的选择 分别对6种成分进行紫外扫描，确定其最大吸收波长；对混合对照品溶液和样品采用DAD检测器进行190～400 nm的全波长扫描，由于6种化学成分的最大吸收波长不同，综合考虑，在270 nm处，各成分均有较大吸收、峰形好，因此选择270 nm为供试品溶液的检测波长。

经方法学研究结果表明，采用HPLC法同时测定丹参中迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA6种化学成分的含量，具有良好的精密度、准确度和重复性，简便易行，可为丹参药材质量评价提供理论依据。

[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010:194.

[2] 娄子洋，张海，李翔，等.HPLC法同时测定中药丹参中水溶性和脂溶性成分的含量[J].第二军医大学学报，2009，30(2):190-193.

[3] 韦辉，刘素香，刘毅，等.丹参药材的综合质量评价研究[J].药物评价研究，2011，34(5):343-347.

[4] 覃华，张琰，杜小燕，等.原儿茶酸对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].西北药学杂志，2015，30(6):709-712.

[5] 王虹，刘红梅，王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药，2009，31(3):354-358.

[6] 柳艳，李磊，刘王莹，等.丹酚酸抗氧化活性及其对DNA损伤保护作用[J].中国公共卫生，2007，23(4):448-449.

[7] 李昌勤，赵琳，薛志平，等.隐丹参酮抑菌机制研究[J].中国药学杂志，2012，47(21):1706-1710.

[8] 林肖惠，徐为人，刘鹏，等.二氢丹参酮Ⅰ的降血脂作用研究[J].中草药，2008，39(9):1378-1380.

[9] 郑国灿，李智英.丹参酮Ⅰ对HepG2细胞抑制作用的体外实验研究[J].现代医学，2004，32(5):296-298.

[10]吴迪，袁鑫，刘金艳，等.丹参酮ⅡA对中毒性心肌炎的防治作用研究[J].湖北科技学院学报，2012，26(6):473-474.

[11]刘勇，霍金莲，龙永春，等.胰岛素与丹参酮ⅡA对大鼠糖尿病周围神经病变的保护作用[J].西北药学杂志，2015，30(6):716-720.

Simultaneous determination of six components in Radix Salvia miltiorrhiza by HPLC

CHENG Qianfei

(Shaanxi Institute of International Trade & Commerce，Xianyang 712046，China)

RadixSalviamiltiorrhiza；rosmarinic acid；salvianolic acid B；dihydrotanshinoneⅠ； clyptotanshinon；tanshinoneⅠ；tanshinoneⅡA；HPLC

陕西省中医管理局中医药科研课题项目(编号：ZY10)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.001

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0551-04

2016-03-21)