改进HPLC法测定吲哚美辛肠溶片中的有关物质

李　超（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆　401121）

改进HPLC法测定吲哚美辛肠溶片中的有关物质

李超＊（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121）

目的：改进高效液相色谱法测定吲哚美辛肠溶片中2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下简称杂质Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下简称杂质Ⅱ）的含量。方法：色谱柱为Phenomenex Phenyl-Hexyl，流动相为10 g/L醋酸溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为40℃，进样量为20 μl。结果：杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的检测质量浓度线性范围分别为0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml（r均为0.999 8）；定量限分别为1.12、0.48 ng，检测限分别为0.340、0.146 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的加样回收率分别为99.71%～100.52%（RSD=0.28%，n=9）、100.84%～102.14%（RSD= 0.47%，n=9）。结论：该方法准确、快速，可用于吲哚美辛肠溶片中杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的含量测定。

高效液相色谱法；吲哚美辛肠溶片；2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸；4-氯苯甲酸

吲哚美辛为吲哚乙酸类非甾体消炎药［1］，临床上主要用于抗炎、抗风湿及解热镇痛等［2］。其作用机制为通过抑制环氧化酶，从而减少前列腺素的合成，制止炎症组织痛觉神经冲动的形成，抑制炎性反应［3］，也可用于癌症发热并有一定的抗肿瘤作用，可抑制结肠肿瘤细胞增殖并诱导凋亡［4-7］。但该药不良反应较多，主要为胃肠道反应，也有哮喘［8-11］、致粒细胞缺乏［12］等不良反应的报道。2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下简称杂质Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下简称杂质Ⅱ）为吲哚美辛的工艺杂质，不可避免，而且是引起不良反应的主要因素。2010年版《中国药典》（二部）［13］和2015年版《中国药典》（二部）［14］收载了吲哚美辛肠溶片，均采用高效液相色谱法（HPLC）测定有关物质的含量，且两版药典中对吲哚美辛肠溶片有关物质的测定方法一致，无修订，但该方法不能有效检出吲哚美辛肠溶片的杂质Ⅰ和杂质Ⅱ。为更好地控制该药的质量，笔者参考2015年版《英国药典》中吲哚美辛有关物质的测定方法［15］，对2015年版《中国药典》（二部）中吲哚美辛肠溶片有关物质测定方法进行了改进。

1　材料

1.1仪器

e2695型HPLC仪，包括2489型紫外检测器（美国Waters公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）；XP205型万分之一电子天平（瑞士万通有限公司）。

1.2药品与试剂

吲哚美辛肠溶片（A厂，批号：140502、131201、150201，规格：25 mg/片；B厂，批号：150401、150101、150601，规格：25 mg/片；C厂，批号：1407006、1402002、1502002，规格：25 mg/片；D厂，批号：141002、140701、141102、150601，规格：25 mg/片；E厂，批号：140804、150501、140502、141105，规格：25 mg/片；F厂，批号：A141002、A130703、A150103，规格：25 mg/片；G厂，批号：17140202、130801、1715003，规格：25 mg/片；H厂，批号：20150102，规格：25 mg/片；I厂，批号：140201，规格：25 mg/片；J厂，批号：815001、824001、774001，规格：25 mg/片）；杂质Ⅰ对照品（西亚试剂有限责任公司，批号：B55980，纯度：98%）；杂质Ⅱ对照品（天津市光复精细化工研究所，批号：20150417，纯度：100%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相：10 g/L醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：40℃；进样量：20 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1混合对照品溶液精密称取杂质Ⅰ对照品和杂质Ⅱ对照品各约12.5 mg，精密称定，置于同一10 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并稀释制成每1 ml含杂质Ⅰ和杂质Ⅱ各5 μg的混合对照品溶液。

表1　梯度洗脱程序Tab 1　Gradient edution program

2.2.2供试品溶液取样品细粉适量（约相当于吲哚美辛50 mg），精密称定，置于50 ml量瓶中，加50%乙腈适量，超声处理10 min，使其溶解，放冷，加50%乙腈定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液取50%乙腈溶液作为阴性对照溶液。

2.3系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞2；理论板数以吲哚美辛峰计为50 000。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.供试品；B.混合对照品；C.阴性对照；1.杂质Ⅰ；2.杂质Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 1　HPLC chromatogramsA.test sample；B.mixed reference substance；C.negative control；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.4破坏性试验

（1）光破坏：精密称取样品细粉适量，分别置于1 500 lx灯下照射24 h，再按“2.2.2”项下方法制备光破坏试验溶液。（2）热破坏：精密称取样品细粉适量，置于120℃烘箱中烘烤24 h，取出后冷却至室温，再取上述烘烤后的细粉适量，按“2.2.2”项下方法制备热破坏试验溶液。（3）酸破坏：精密称取样品细粉适量，加2 mol/L盐酸溶液5 ml，于室温下放置80 min，再加2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至中性，再按“2.2.2”项下方法制备酸破坏试验溶液。（4）碱破坏：精密称取样品细粉适量，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，于室温下放置8 min，加0.1 mol/L盐酸溶液调节pH至中性，再按“2.2.2”项下方法制备碱破坏试验溶液。（5）氧化破坏：精密称取样品细粉适量，加30%过氧化氢溶液10 ml，摇匀，于室温下放置2 h，再按“2.2.2”项下方法制备氧化破坏试验溶液。分别取上述破坏试验溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。由图2可知，样品在酸碱条件下不稳定，能够降解出杂质Ⅰ和杂质Ⅱ；在光破坏、热破坏和氧化破坏条件下比较稳定，不易被破坏。

图2　破坏性试验高效液相色谱图A.酸破坏；B.碱破坏；C.氧化破坏；D.光破坏；E热破坏；1.杂质Ⅰ；2.杂质Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 2　HPLC chromatograms of destructive testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by light；E.sample destroyed by heating；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.5线性关系考察

取杂质Ⅰ对照品和杂质Ⅱ对照品各约25 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并定容，摇匀，作为单一对照品贮备液。分别取上述单一对照品贮备液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得杂质Ⅰ的回归方程为y=17 756x－983.32（r=0.999 8）、杂质Ⅱ的回归方程为y=42 670x－1 637（r=0.999 8）。结果表明，杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的检测质量浓度线性范围为0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml。

2.6定量限与检出限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限分别为1.12、0.48 ng；当信噪比为3∶1时，得检测限分别为0.340、0.146 ng。

2.7精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，杂质Ⅰ和杂质Ⅱ峰面积的RSD分别为0.22%、0.10%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8稳定性试验

精密量取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质Ⅰ和杂质Ⅱ峰面积的RSD分别为0.67%、0.70%（n=5），表明供试品溶液在室温下8 h内稳定性良好。

2.9重复性试验

取同一批样品（批号：1715003）适量，除去包衣后研细，称取约2片细粉（约相当于吲哚美辛50 mg），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质Ⅰ和杂质Ⅱ峰面积的RSD分别为0.81%、0.75%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.10加样回收率试验

取样品（批号：1715003）适量，除去包衣后研细，取约2片细粉（约相当于吲哚美辛50 mg），精密称定，分别置于50 ml量瓶中，分别加入“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0、2.0、3.0 ml，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得系列溶液。取上述系列溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果详见表2。

表2　加样回收率试验结果（n=9）Tab 2　Results of recovery tests（n=9）

2.11样品含量测定

分别取28批样品各适量，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的含量，结果详见表3。

3　讨论

3.1检测波长的选择

笔者曾考察了检测波长（228、240和254 nm），发现在228 nm和240 nm波长处，系统基线不稳定，影响了杂质的检测，而在254 nm波长处基线稳定且杂质检测结果也较好。因此，本试验最终选择254 nm作为检测波长。

3.2破坏性试验条件的确定

在进行酸破坏试验时，笔者曾用1、2、6 mol/L的盐酸溶液进行酸破坏。结果显示，1 mol/L的盐酸溶液基本无法破坏出杂质，说明破坏条件不够剧烈；6 mol/L的盐酸溶液破坏出的杂质峰过大，以至于主峰吲哚美辛的峰面积过小（＜50%），说明条件过于剧烈。因此，最终采用2 mol/L的盐酸溶液进行酸破坏试验，主峰的峰面积适宜（占80%左右），说明该破坏试验条件适用，且破坏出的杂质能被有效检出。

在进行碱破坏试验时，笔者曾用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液分别破坏2、8、15、30 min。结果显示，15 min以上的破坏使得主峰吲哚美辛被破坏过多（＜50%），2 min的破坏时间过短，主峰吲哚美辛基本没有被破坏。因此，最终确定8 min的破坏时间，破坏之后主峰的峰面积适宜（占80%左右），说明该破坏试验条件适用，且破坏出的杂质能被有效检出。

其他光、热和氧化破坏条件均没有破坏出杂质，说明本品对光、热和氧化条件比较稳定。

表3　样品含量测定结果（n=3，%）Tab 3　Results of related substances determination of samples（n=3，%）

综上所述，本方法准确、快速，可用于吲哚美辛肠溶片杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的含量测定。

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［15］ British Pharmacopoeia Commission office.British Pharmacopeia.：European Pharmacopoeia VolumeⅡ［S］.2015：1 204-1 206.

（编辑：刘柳）

Determination of Related Substance in Indometacin Enteric-coated Tablet by Improving HPLC

LI Chao（Chongqing Institute For Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To improve HPLC for the contents determination of 2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid（impurityⅠ）and 4-chlorobenzoic（impurityⅡ）in Indometacin enteric-coated tablet.METHODS：The column was Phenomenex Phenyl-Hexyl with mobile phase of 10 g/L acetic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，column temperature was 40℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.262 2-5.243 0 μg/ml for impurityⅠ（r=0.999 8）and 0.252 5-5.050 0 μg/ml for impurityⅡ（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 1.12 ng and 0.48 ng，limits of detection were 0.340 ng and 0.146 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 99.71%-100.52%（RSD=0.28%，n=9）and 100.84%-102.14%（RSD=0.47%，n= 9）.CONCLUSIONS：The method is accurate and rapid，and can be used for the contents determination of impurityⅠand impurityⅡin Indometacin enteric-coated tablet.

HPLC；Indometacin enteric-coated tablet；2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid；4-chlorobenzoic

R927.2

A

1001-0408（2016）27-3861-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.39

＊主管药师，硕士。研究方向：药物分析。E-mail：179320851 @qq.com

（2016-01-21

2016-07-04）